kl800.com省心范文网

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_图文

3.1 酶的制备及活力测定

辣根过氧化物酶的制备及活力测定
实验目的和要求
1.掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法。 2.掌握过氧化物酶的活力测定方法。

过氧化物酶催化以下反应?

2H 2 O 2 →O 2 +2H 2 O?
这一类酶以铁卟啉为辅基,所以属血红素蛋白质

类 (hemeproteins)。过氧化物酶在生物界分布极广,
在细胞代谢的氧化还原过程中起重要的作用。

辣根过氧化物酶 (horse radish peroxidase,简称

HRP,EC.1.11.1.7)是植物中研究得最深入的一种过氧
化物酶,早在20世纪30年代就有人着手从辣根中分离

此酶,以后又制备出结晶。本实验是以辣根为原料,
经过水的抽提,硫酸铵和丙酮分级分离,再经锌离子 纯化,透析除盐,冰冻干燥,便可得到高纯度的辣根 过氧化物酶。

辣根过氧化物酶是一种含亚铁血红素的蛋白质 ,Mr在40 000左右,等电点7.2。溶于水,溶解度为5%(W/V),溶液呈棕 红色,透明。HRP可溶于0.58饱和度以下的硫酸铵溶液,而 0.62饱和度以上则不溶。该酶最适pH7.0(对愈创木酚为氢给体

而言)。在室温下,HRP几周内稳定,加热到63℃,在15min内
稳定。氧化还原电势很低,pH6.08时,E ' 0 =-0.2070V,pH为 7.71时,?E ′ 0 =-0.2787V。 ?

1.RZ值:提纯工作的后几步,以及纯酶溶液可用RZ值表明 酶的纯度。RZ= A403nm/A275nm?,403nm处的吸收代表血 红素辅基的吸收,275nm的吸收是蛋白质的吸收,结晶的HRP 的RZ值为3.04。测定时的酶浓度为1mg蛋白/mL。?

2.愈创木酚法:测k4。以愈创木酚(邻甲氧基酚,guaiacol)
为氢给体,其反应产物四邻甲氧基连酚.有色产物四邻甲氧基连 酚生成的速度(dx/dt)与底物过氧化氢及氢给体愈创木酚的浓度 有关。 本实验是采用测定 k4的方法来判断酶的纯度。

一、 HRP的制备? 1.水提取:称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根(辣 根皮中亦含有丰富的HRP),用菜刀切成小碎块,在绞 肉机中绞碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水低温下搅 拌提取过夜(亦可采用高速抽提法)。次日用甩干机(或 离心机)甩干,收集滤液,碎渣再用1/4倍体积水浸泡 提取1次,合并2次滤液,测得总体积。

2.硫酸铵分级分离:在不断搅拌下,每1 000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵 粉末(相当于0. 40饱和度,0℃),大约在1~2h内加完,置冷室中放置过夜。 次日将上清液小心地用虹吸管移出,下面混浊液以3 000r/min离心15min, 弃沉淀,合并上清液。再按每1 000mL上清液加258g硫酸铵粉末(0.8饱和度) 随加随搅拌,当硫酸铵全部溶解后,置冷室过夜。次日,虹吸出上清液,沉 淀部分在冰冻离心机中以13 000r/min离心20min,弃去上清液,收集沉淀。 将沉淀悬浮于100~150mL蒸馏水中(加水量要使沉淀全部溶解为止),分装于 透析袋内,放在流动自来水中进行透析1~2天,直到硫酸铵透析完毕为止 (可用5%乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查)。然后改换成用蒸馏水透析,中间 更换2~3次,用0.1mol/L硝酸银溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液

合并,在冰冻离心机中以4 000r/min离心15min,弃去沉淀,量上清液的体
积。?

3.丙酮分级分离:将上清液倒入烧杯并置冰盐
浴中,在不断搅拌下,用细滴管沿杯壁加入1 倍体积预冷至-15℃的丙酮,放置片刻,在

冰冻离心机中以4 000r/min离心15min,弃去
沉淀。上清液再加入0.8体积(按原上清液体积) -15℃丙酮,(操作同上),静置后,在冰冻 离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸 馏水中,透析除丙酮。可得?RZ?值近于1的 酶溶液。

4.精制:将上步酶液适当稀释,滴加1mol/L
硫酸锌溶液,使酶液中锌离子浓度为10 -3 mol/L,5 000r/min离心10min,得上 清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤,离 心,洗液与清液合并,分装于透析袋内, 用水透析除盐,用微孔滤膜过滤,进行 真空冰冻干燥(约得20mg),产品呈米黄

色纤维状松软物,HRP产品的?RZ?值
可达3.0左右,置真空干燥器中低温保存。 ?

二、 HRP的活力测定?
1.活力测定:测定k4值的方法操作如下:取2个比色池(带盖,
光程1cm),按表加入反应物。

对照样品
磷酸盐缓冲液 愈创木酚溶液

反应物 2.90mL 0.05mL 0.01mL

2.91mL 0.05mL 0.0mL

酶液

酶液:将1mg蛋白/mL的酶液用磷酸盐缓冲液稀释10倍后使用。

加好反应物,摇匀,在 470nm读出A470nm值,为t=0时的读数。立

即加0.01mL40mmol/L过氧化氢溶液于2个比色池中,即刻摇匀并记时,每
隔30s读数1次,约5min,并记下实验时的室温。? 将所测样品的 A470nm值减去相应时间对照的A470nm值,然后以

A470nm值为纵坐标,时间为横坐标作图,得一直线,计算出平均每分钟
光吸收的增加,即求出△x/△t?,按公式(8)求出k4值。或不求k4值,而 把在上述条件下,每分钟A470nm增加0.001所需酶量定为1个HRP活力单位。 ? 2.蛋白质含量的测定:将酶液适当稀释后,用Bradford法比色测定蛋白质 含量,

1.计算产品的RZ值及k4值。?
2.计算产品的比活力。?

1.盐析法制备辣根过氧化物酶的原理是什么?? 2.愈创木酚法测定辣根过氧化物酶的原理是什么?? 3.测定辣根过氧化物酶的活力时,要求什么样的pH和 温度?是否需要先测定酶液的蛋白质含量??

? ?

shangshenss.com 散文精选_祝福语录 esnverhui.com 思想汇报,毕业论文,述职报告 51879587.com 闽南新闻网,海峡都市报,地区资讯新闻 youa58.com 时事滚动新闻 zhedbaie.com 明星八卦、影视综艺、历史趣闻

事情,理解着她的想法,一边又觉得一个人有改变而且是变得开朗了是一件多么令人愉快的事情啊。也许是现代人的思考问题的方式 吸引了她,每当她问及一些问题然后寻求我的答案的时候,我总是说到一些前人无法完全理解的思路。而她问得最多的就数男女之间 的关系问题了。我大致能猜出仁玉是个极度相信并渴望爱情的人儿了。从上次在湖边无意透露了她的情感想法,而我如斯地仔细听后, 她就觉得在我面前说这些话已经是不失礼的事情了,我简直成了她的“闺蜜”。谁叫我穿越之前就拥有着一切女孩子该有的“性格” 呢!我在她面前提过了我那时代的一夫一妻制,她甚是有兴趣。她理解了我的观点,知道了男人会钟情于唯一一个女人,女人也是终 生只有爱他的丈夫,绝对没有小妾的存在。她惊奇的是这样的男子为什么会只娶一个,感叹的却是她身不由己要去做别人的小妾。现 代爱情观真不适用这封建社会的爱情观,但是每个时代都有适应这个时代的规律存在,只是这个规律会随着时间被另一个新规律所替 代,但现在是不适宜对它抱怨什么或者去改变它什么的。日子就这样过着,但是离仁玉嫁去傅家的日子也越来越近了。仁玉的心态貌 似摆的很好,也许是我跟她聊了许多的缘故吧,她已经不为自己嫁去陌生的家族而感到绝望了,但是她还是有点小怕,因为她从来没 想象过她会有勇气去面对这一切。仁家没有什么女子能用的化妆品,于是在得到仁老夫人同意的情况,我陪同仁玉姐弟一起上了街市。 在这些日子里,仁老夫人并没有和我说过几句话,但也可能觉得我不像是什么坏人,而且又是个比较年长的男丁,于是也允许我住在 仁家,这次也让我好生帮她看着她的孙女和孙子。白天的街市实在是热闹。我曾听说过,古时的街市,到了晚上是不允许有人继续在 街上走动的,那是所谓的门禁吗?但是,那些电视剧所拍的古装大戏里头,为啥会有这么多小贩打亮着灯笼在叫喊做生意的呢?仁家 确实是没钱,仁玉这女孩也只光顾街边那大婶们摆出来的胭脂水粉的摊位罢了。我觉得嘛,古代的化妆品的质量实在是有够差的。那 些粗俗的红粉就这么被抹上脸蛋去,抹成像个白里透红的猴子屁股而被人取笑也罢,要是惹来皮肤病亦或是得个什么过敏症时,那就 实在有够惨的。正当仁玉在仔细挑选着胭脂的时候,在闹市远处传来一阵急促的马踏声响。我回头一看,一惊,看到了一匹脱缰的棕 色大马向我们这人流密集的街市冲了过来。不妙,赶紧躲起来以免受伤,于是我下意识的往右侧倒去。刚倒下,才发现,我又是只顾 着自己的安危,忘记了仁家两姐弟了,心中又是一阵惭愧。刚想爬起来去拉走这在看胭脂的仁玉,才发现来不及了。眼见大马要踏过 她们向前奔去,此时,一个人影从后方飞来,一把


生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_图文.ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) 3.1 酶的制备及活力测定 辣根过氧化物酶的制备及活力...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1).ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) - 3.1 酶的制备及活力测定 辣根过氧化物酶的制备及活力测定 实验目的和要求 1.掌握盐析法制备活性蛋白质的...

高中生物 3.1 酶的制备及活力测定课件 中图版选修1_图文.ppt

高中生物 3.1 酶的制备及活力测定课件 中图版选修1_理化生_高中教育_教育专区。高中生物 3.1 酶的制备及活力测定课件 中图版选修1 ...

高中生物 3.1 酶的制备及活力测定名师优质课件 中图版....ppt

高中生物 3.1 酶的制备及活力测定名师优质课件 中图版选修1_理化生_高中教育_教育专区。第一节 酶的制备及活力测定 1.研究酶的存在和简单制作方法。 2.尝试...

...年高中生物选修一:3.1《酶的制备及活力测定》ppt课....ppt

中图版】2018年高中生物选修一:3.1《酶的制备及活力测定》ppt课件 -

高中生物 3.1 酶的制备及活力测定课件 中图版选修11_图文.ppt

高中生物 3.1 酶的制备及活力测定课件 中图版选修11_理化生_高中教育_教育专区。高中生物 3.1 酶的制备及活力测定课件 中图版选修11 ...

中图版生物选修1第一节 《酶的制备及活力测定》ppt课件.ppt

中图版生物选修1第一节 《酶的制备及活力测定》ppt课件 - 辣根过氧化物酶的制备及活力测定 实验目的和要求 1.掌握盐析法制备活性蛋白质的原理及方法。 2.掌握...

中图版高中生物选修一3.1《酶的制备及活力测定》PPT.ppt

中图版高中生物选修一3.1《酶的制备及活力测定》PPT_理化生_高中教育_教育专区...上一页 返回首页 下一页 一、酶的存在及提取 1.酶是在 生物体活细胞 中...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_图文.ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) 3.1 酶的制备及活力测定 辣根过氧化物酶的制备及活力...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_图文.ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) 3.1 酶的制备及活力测定 辣根过氧化物酶的制备及活力...

高中生物同步课件:31酶的制备及活力测定中图版选修1_图文.ppt

高中生物同步课件:31酶的制备及活力测定中图版选修1 - 第三章 酶的制备及应用 第三章 酶的制备及应用 第三章 酶的制备及应用 第1节 酶的制备及活力测定 ...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_图文.ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) 3.1 酶的制备及活力测定 辣根过氧化物酶的制备及活力...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_图文.ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) 3.1 酶的制备及活力测定 辣根过氧化物酶的制备及活力...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_图文.ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) 3.1 酶的制备及活力测定 辣根过氧化物酶的制备及活力...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_图文.ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) 3.1 酶的制备及活力测定 辣根过氧化物酶的制备及活力...

3.1 酶的制备及活力测定 课件(中图版选修1) (1).ppt

3.1 酶的制备及活力测定 课件(中图版选修1) (1)_高三理化生_理化生_高

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1).ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_其它课程_初中教育_教育专区。生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) ...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1).ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_其它课程_高中教育_教育专区。生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) ...

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1).ppt

生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1)_其它课程_高中教育_教育专区。生物:3.1《酶的制备及活力测定》课件(中图版选修1) ...

...年高中生物选修一:3.1《酶的制备及活力测定》ppt课....ppt

中图版】2018年高中生物选修一:3.1《酶的制备及活力测定》ppt课件 -