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中药红毛五加化学成分的高效液相色谱电喷雾电离质谱质谱(HPLCESIMS2)分析

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中药红毛五加化学成分的高效液相色谱/ 电喷雾电离/ 质谱/ (! # / &/ & ) 质谱 " $ % ’ ( ) 分析
王祝伟, 孙毓庆
(沈阳药科大学药学院,辽宁 沈阳 &"& ) &": 摘要: 建立了中药红毛五加化学成分的 = ? / A/ A 定性分析方法。液相色谱条件:6FGA$ & 色谱柱 !" (( > @ )B C ! DE+ H@9 流量"9* / , ; 二极管阵列检 * 8:* JJ(" )乙腈 水 *I J *,K , * ; $ (用冰醋酸调 L 为#" 梯度洗脱, = J) J ? *4 柱温# "M; 测器 N N)检测波长!84 。质谱条件:P3Q离子阱质谱仪; ( O , 电喷雾离子 ) B 源; ( A ) 正离子检出模式。采用该 ( * O, 4 方法得到了红毛五加的紫外 R ) ( S 色谱图、 总离子流色谱图 7 @) ( B 和萃取离子色谱图 )@) 以及相应色谱峰的 ( B , 对其进行解析, 鉴别出红毛五加中的鸟苷、 腺苷和紫丁香树脂苷成分。方法简便、 快捷和准确。 )@ C ! 的质谱图, B/ A 关键词: 高效液相色谱; 电喷雾电离; 质谱; 鸟苷; 腺苷; 紫丁香树脂苷; 红毛五加; 中药 中图分类号::9 T( 文献标识码: O 文章编号: "$%#!" ) $(8" ( & "9& "#" "($8 " :

!+ -/. 24 *67$ . 1 8+2 ,/ ; 8092 ’3 2 0/ *,".0 1 3-#5* ,0 20.9 : %- .<.: 0* 8 3 4 =* ( < &-80 - : > 2 < 0 !#%’# # * #. # 0 2< 94 18 ) 3; * / "$&($ ) + -+ , 1 . . , +/ :<
UO WD ; 3, R V X Y, A VZ < P ;, 4
(!#$ $ ’ ( * " , #-(.’ ( * "/ "%2 1, 1 , #-(.565 , #- ) "$ & #) (+ !,+- #) ( 0 ( -3)0 !,+- 567 81( % ,1 4+

> < 28 OX XLE E +/ - ; X6 + P+X/- Q 2E1 6, Q 4 *2 23Q *Q1 *2 ?8 4 : , 3 6* 43, , E *Q EL 13 / 6L+ ,4 + 6/ + L/ 6 3 / + . [ 6 3E \, 2 E E 2 P < K/ !) 23Q *Q1 = ? / A/ A *Q6 + 34K.-LK[EQ3<+Q ,3++ 2 [ 9(: E E 3XKX2F3 33 3 6 X ;-+ . 4- , 6 ,Q L/ 6 3 ( > @ ) B C 1 26 "-

0$( ( . (= ( * 5 X 3++ 6 + LE E 3 4DE+ H@9/- * (!"* #; - < 1 %1 ) 4 7 32LE ,4Y2 3 6* K6 6FGA$ & 6 4 ( *I8: ) 1> Q [ ; J * JJ (" ) , P+,4 3 Q 46 +3 4 E3YQ ( X L Y2 K 2 KQ J , /Q *,K , * YQ EK Q - , [ /Q ,,$ + E Q3 = + +] Q 6#"YQ 3 / X 3 ;6 6 Q3 ;3 X+ ,
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中药红毛五加是五加科植物 9(0$( ( . "-#; - < 1 : 《 中 )%1 ( * 的地上茎皮。据考证, 神农本草》 (= 1> ) 4 记载的豺漆五加即当今的红毛五加。红毛五加具有 通关节强筋骨之功效。现代药理研究表明, 红毛五
[ [ 加有解热镇痛 &] 抗炎 !] 抗病毒 #] 保肝 8] 抗肿 、 [ 、 、 [ 、 [ [ 瘤 (] 和增强免疫力 :]等多种药理作用。急性和亚

物。红毛五加与刺五加在化学成分和药理作用方面 有着很多相同点。红毛五加广泛分布在我国四川、 甘肃、 青海、 宁夏等地, 资源丰富, 有广泛的开发前 景。目前, 对刺五加的研究开发已经比较全面, 而对
[ ’ 红毛五加的研究仅局限在药理作用及化学成分 9,]

方面, 对于红毛五加的质量控制方法研究的文献仅
[" 有一篇 & ] 。尚无文献报道有关红毛五加化学成分

急性实验结果表明, 红毛五加毒性甚小, 较大剂量、
[ 较长时间用药均安全 %] 。

的液相色谱 质谱 ? / A 分析情况。本实验采用 / ( @C ) 高效液相色谱 电喷雾电离 质谱 质谱方法对红毛 / / /

红毛五加与刺五加是五加科同科属的近缘植

收稿日期: "$%! ! #"$! " 作者简介: 王祝伟, &% 年生, 女, ( 博士研究生,$ + :/1* 3 2 +/ *5 ’ ) *, . 02 , ! , 5 -, - 4 6 通讯联系人: 孙毓庆, 教授, 博士生导师, 从事药物分析研究,3: ! ) 9!" ,$ + : 4; ! &4/ *5 ( 7- "8! 8:! ) *, 2 1< !/ 5 # -; 6

第D期

王祝伟等: 中药红毛五加化学成分的高效液相色谱 电喷雾电离 质谱 质谱分析 ?::? / / / : 见图" , )为进一步深入开发红毛五加以及研究红毛 五加的质量控制方法奠定了基础。

五加中化学成分进行定性分析, 鉴定出红毛五加中 鸟苷、 腺苷和紫丁香树脂苷!个成分 (其分子结构式

图 ! 鸟苷 " 、 ( ) ( )腺苷 # 和紫丁香树脂苷 $ 的分子结构式 ( ) %’! ) + - . 0-0./ 1 -2/ , " , 32/ , # "3& *,3&( ) &( * $+ / $-, * ’"* 2( ) ",* 2( ) 2 +&32. $ , " . & & . 2

! 实验部分
!! 试剂与样品 ( 乙腈为色谱纯, 美国 # %&’ 公司产; 水为娃哈 $ 哈纯净水; 其他试剂均为分析纯。红毛五加产于四 川省, 由沈阳药科大学孙启时教授鉴定。 !4 仪器及条件 ( 美国 ’) , 公司 ". + + 液相色谱 2 型 * "./0 / ) 13 (+多级离子阱质谱联用仪。数据处理系统为美国’) 1 ( 公司化学工作站 4 + / - , 。 ( 5 6- ) ) *, +78 !4! 液相色谱部分 (( 包括低压四 ’) , ". 型高效液相色谱仪, * (+-". 元梯度泵、 二极管阵列检测器 # #". 9., ) ( ’ 9!: 6 、 自动进样器、 柱温箱、 在线脱气机。 色 谱 柱: 8<=21 "(@. 6 ABD 6 ;07 >4? : 6 C 6 乙腈 1 ( 溶液 )E , " )流动相: (’) 水 >) (用冰醋 CC : 6 ; 酸调 F C ) 二 元 线 性 梯 度 洗 脱, H’ . 6,) , @ ( ) G!.
@ ) .6, " ) .6,

(. : 3 去离子水加热回流提取@ 次 D 和 ! ) ) .6 .6, 。 合并提取液, 过滤, 减压浓缩至约 " 3, :6 加入 9 H : 乙醇适量, 进行醇沉, 使乙醇浓度达 O H。在低温 . 下放置@ 后取上清液, 减压浓缩后用 ( I左右) B B5 滤液作 水定容至@ 3, .B " 微孔滤膜过滤, :6 用 C: 6 为 G 3 / 2分析样品。 K4&

4 结果与讨论
4! 色谱图 ( 通过对红毛五加茎皮水提液样品进行 # # ’ ( M 扫 ". B., 紫外 P ) 描 和 离 子 阱 质 谱 !/ 9!. 6 " 得到紫外色谱图和总离子流色 ". " . 全扫描, . ! .. 谱 Q4 图 ( $ )(见图@ 。 ) 利用质谱工作站所提供的提取离子功能, 分别 并获得 萃取出 !/ 为 @B @? O: 的提取离子, " ? ,D ,D 萃取离子流色谱图 J 4) ( $ 。上述 ! 种提取离子的保 留时间分别为 9D "C ,9@6, C ,.: @C ) 。由于总离子流 色谱 图 与 紫 外 色 谱 图 之 间 有 .B 6, 的 延 迟, 则 C ) J 4为 !/ @B @? O: 的提取离子色谱峰所对 $ " ? ,D ,D 应的紫外色谱图中色谱峰的保留时间分别为 9@ C, "C , C ) 。 ."@ ?6, ? 44 一级和二级质谱解析 (
R 在正离子模式下, 经常会同时出现 &RG] , [ R [&RS ] ,&R%] 等一系列准分子离子峰。 7 R[

!" H ’ @ 6,) : (. )

" ) :6,

( : ) ! @ H ’ ! 6,) :

!! H’ B ) ) 其中百分数值均为体积分 : ( :6,( 数, 下 同 此 ) 以 ;检 测 波 长 @B , ;流 速 .? : 6 C 自动进样, 进样量:" 。 6 / ); 3 6, 柱温! I; . 3 !44 质谱部分 (( ’) , "./0 /2 型多级离子阱质谱仪; * ) (+-". + + 3 电喷雾离子源 J $ ; ( 2 ) 正离子检出模式; 雾化气压力 (氮气) 流量 93 6, 干 / ); .@ K ( :F )干燥气 CB& 7 ! / ; ) 燥气温度!. I; 电喷雾电压 BL ; : M 扫描范围 !/ " ( 4 ! .. ". " . ; . ! .. 离子电荷控制 $ 4). . 。采用自动 二级 质 谱 和 自 动 参 数 设 置 2 7 77 + 02( 60 06- + -K + 1 - ( 2 2 模式。柱后分流比"" 。 ) ,K ) , N. 样品的处理 !5 ( 将红毛五加茎皮粉碎, 称取 :( 分别用 ". 和 , .

J 4 中 !/ @B 峰的一级和二级质谱图分别 $ " ? R 如图!7<所示。!/ @B. 为 &RG] 离子峰, 1, " ?C [ 即 "@B 为 其 失 去 " 个 核 糖 分 子 的 碎 片 离 子 峰, :C R R 离子峰, [&RG] T"@ !@" 为 &R%] ! ;@C [ ".: 9C
R 为其失去 " 个核糖分子的碎片离子峰, [&R%] 即

T ! 。因此可以确认图@<中保留时间为 9D6, "@ 1 C ) (J 4 为 !/ @B 的色谱峰是鸟苷峰。 $ " ?)

?:?? :





第9 卷 4

图 ! 红毛五加水提液的紫外色谱图 " 和总离子流色谱图 # ( ) ( ) $&! ( +- "-, . " "124*, ./&" ( )5 + 6/"/ 5!#%’## +#. #0 %’ )*, ./&" ( ) 0 3 +- "-, . # - /6 7 * - "$&($)* -+ , 1 , , +/ ! # &()’ : &.013 4 %68 ( : 8< > 8)( , ! ) / 7A ) -( ’ A * ’& /A ’ -A ’ / - E > " $%’)&+ ,-/ 2$5 & ’ 9;8 =?8 >> : 8 @+ +(@ BC/) * 6 ) D %* )) /(@* ( !F; * 7 * A 7& & *6 A @ B/A% % )+8 .A B+ ) /6@- A D > # 8’ * ;GH B %68 A6A*@+8 ’ &A / K9=’ ) )( / / (3 ) %* / ( / &) E/A@ B D / & ;58 / ) / F * ) ) 6 * & * I A & ’ D7’ / &) -( *J : 8@ B( A - L A 7 D * * & *% - M M) 1 &()’ :6 * +-L &) * ’ E+)A A %& &A ’.6A C+ -+7A ;9 "( :E ) (L CC+6@- A A &( N HO %’)&+ A % &E/ )’ /& ; &* (* * ’8 ( ; A7P- / EA - , >=O / F + ; -) / D * * AP) )Q A ) ) + ) ’ & / , * / ) ; -) *8 A/ - , : R# 8’ (L C A E- 7A F; GH ’ * 4 C/& ’ ; H A& ’ ; H )(’- H H ’+ A 9/ ’+ A F6 &A( ’ 7 ) ( ) ) )

图 8 鸟苷的一级 " 和二级 # 质谱图 ( ) ( ) ( $&8 93. ;( ) 0 "; # ;6/"- &"- 0 % ’ : "; " "1. ;! )<* 5 =0; 6 , %

S $ 中 !/ 95 峰的一级和二级质谱图分别 T " ? V 如图=/.所示。!/ 9UR 为 OV!] 离子峰, , 3 " ?> [ 即 4?9 为 其 失 去 4 个 核 糖 分 子 的 碎 片 离 子 峰, F>

V [OV!] W49 F 。因 此 可 以 确 认 图 9. 中 保 留 时 3 间为 ;: 8’ S $ 为 !/ 95) 色 谱 峰 是 腺 ( T 的 4> ) " ?

苷峰。

图 > 腺苷的一级 " 和二级 # 质谱图 ( ) ( ) ( $&> 93. ;( ) 0 "; # ;6/"- "6- 0 % ’ : "; " "1. ;! )<* 5 10; 6 , %

S $ 中 !/ U: 峰的一级和二级质谱图分别 T " ? 如图 :/ . 所 示。!/ U:= 为 OVX ] 离 子 , 3 " ?> [ /V 峰, FF 和 =4? 分别为其失去 4 个葡萄糖分子 ? > ; => 和 9 个 葡 萄 糖 分 子 的 碎 片 离 子 峰, 分 别 为 即 [OVX ] W49 和 OVX ] W49W49 U49 /V ? [ /V ? ? ;5>

V 为 OVY] 离子峰, :%为其二级质谱图。!/ [ 图 3 " V UFF为 OVY] 峰失去 9 个水分子的碎片离子 ?> [ V 峰, R9为 OVY] 峰失去 4 个葡萄糖分子的碎 ? > [ 4 V 片离子峰, ::为 OVY] 峰失去 4 个葡萄糖分 = > [ ? 子 及$ ! Z 的碎片离子峰 $ ! Z 碎 片 结 构 见 图 ( 5 R F 5 R F

第!期

王祝伟等: 中药红毛五加化学成分的高效液相色谱 电喷雾电离 质谱 质谱分析 ?.-? / / / .

图 ! 紫丁香树脂苷的一级 " 和二级 #$ 质谱图 ( ) ( ,) ( %’! )+, -( ) . "- #$ -23"5 7&/.4 & ( * "- " "/, -0 ,)1$ 6& 52/& 4 4 .

) ! 。因 此 可 确 认 图 "$ 中 保 留 时 间 为 "& ’) # %" ( (* , 为 !/ -. 的色谱峰是紫丁香树脂苷峰。 ) + " !
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参考文献:
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,
" " "

01 ,2 0 1

图 8 9 ; => 碎片结构式 : < ? %’8 @2 3B34 5 329 ; =>6" , . & ( A - $B2 6 A : < ? 4’ 23 4

0? 讨论 ( 提取方法的考察: 本实验先后采用 3 ,. , 4"4 . 4, 4, 3 系列浓度的甲醇或乙醇为提取溶 3 . 5 4 3 剂, 对红毛五加茎皮进行加热回流提取。比较各提 取液的色谱图发现, 水提液的色谱图中色谱峰数最 多, 这样有利于对红毛五加进行 1 7 / 9 定性分 6,8 析, 所以最终选用水为提取溶剂。为了防止水提液 中的多糖、 蛋白质、 鞣质的极性大分子杂质干扰测定 并污染色谱柱, 采用了水提醇沉法将这些杂质除去。 0C 结论 ( 用 1 7 / 9/ 9 法鉴定了红毛五加中鸟苷、 6 , *+ 8 " 腺苷和紫丁香树脂苷成分。以乙腈 水 # (冰醋酸调 1 &) ;; : 为23 为流动相梯度洗脱, < 串联离子阱质 谱检测。通过对 !/ "> "= -. 的提取离子色 " = ,! ,! 谱图及其一级和二级质谱的碎片离子进行分析, 鉴 别出 ? , 中保留时间分别为%!5& , & ( 的 + & , ." "’) 3 % 色谱峰依次为鸟苷、 腺苷和紫丁香树脂苷, 其相对应 的紫 外 色 谱 图 中 色 谱 峰 的 保 留 时 间 分 别 为 %" &, 5& , & ( 。运用 7 / 9进行定性分析具有准 35 " =’) = ,8 确度高、 灵敏度高的特点, 而且能解决因缺乏对照品 而无法进行定性研究的困难。所述实验工作为进一 步阐明红毛五加茎皮水提液中其他化学成分及红毛 五加质量控制方法的建立奠定了基础。

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01 ,2