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宿主vero细胞DNA残留量SOP

宿主 vero 细胞 DNA 残留量操作规程
试剂 (1)DNA 标记和检测试剂盒 (2)TaKaRa universal Genomic DNA Extraction Kit ver3.0(DV811A) (3 ) TaKaRa DNA Fragment Purification Kit(807A) (4)DNA 杂交膜: 尼龙膜 (5)2%蛋白酶 K 溶液:称取蛋白酶 K0.20g,溶于灭菌水 10ml 中, 分装后储存于-20℃备用。

(6) 3%牛血清白蛋白溶液 :称取牛血清白蛋白 0.30g,溶于灭菌水
10ml 中。

(7) 1mol/l 三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液(Ph8.0):用盐酸调 pH 至
8.0。

(8) 5.0mol/l 氯化钠溶液
(9)0.5mol/l 乙二胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)用 10mol/l 氢氧化钠 溶液调节至 8.0。 (10)20%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液:用盐酸调 pH 至 7.2。 (11)蛋白酶缓冲液(pH8.0)量取 1mol/l Tris 溶液 1.0ml(pH8.0) , 5mol/l 氯化钠溶液 2.0ml,0.5mol/l 乙二胺四乙酸二钠溶液 (pH8.0)2.0ml,20%SDS 溶液 2.5ml,加灭菌水至 10ml。 (12)TE 缓冲液(Ph8.0)量取 1mol/l Tris 溶液 10ml,0.5mol/l 乙二 胺四乙酸二钠溶液(pH8.0)2ml,加灭菌水至 1000ml。 (13)1%鱼精 DNA 溶液:精密称取鱼精 DNA0.10g,置 10ml 量瓶中,

用 TE 缓冲液溶解并稀释至刻度,摇匀,用 7 号针头反复抽打 以剪切 DNA 成为小分子,分装后贮藏于-20℃备用。 (14) DNA 稀释液: 1%鱼精 DNA 溶液 50μl, TE 缓冲液至 10ml。 取 加 (15)washing buffer:0.1M 马来酸;0.15M 氯化钠;0.3%Tween 20; PH7.5。 (16)马来酸溶液:0.1M 马来酸;0.15M 氯化钠;PH7.5。 (17)检测液:0.1M Tris-Hcl;0.15M 氯化钠;PH9.5。

一、用于标记探针和阳性对照的 DNA 制备 用于标记探针和
1.DNA 的提取: TaKaRa universal Genomic DNA Extraction Kit ver3.0 用 (DV811A)试剂盒提取 DNA。 2.测定 DNA 的吸光度: TE 将 DNA 稀释适当倍数, DNA 的 A260 用 使 值在为 0.2-1.0 之间 (一般为 40 倍) ,然后在紫外分光光度计测定其 波长在 260nm 和 280nm 的 OD 值, 并且 A260/ A280 应在 1.8-2.0 之间。 其含量(?g/ml)为:A260×50×稀释倍数。 3.酶切 DNA:取 DNA 约 1?g,用 HaeⅢ酶(TaKaRa D1051A)酶切 1 小时,用 1%琼脂糖凝胶电泳检测其片段大小是否被切开。 4.酶切反应液中 DNA 的回收:使用 TaKaRa DNA Fragment Purification Kit(807A)回收酶切反应液中的 DNA, 然后在紫外分光光度计测定 其波长在 260nm 和 280nm 的 OD 值,并且 A260/ A280 应在 1.8-2.0 之 间。其含量(?g/ml)为:A260×50×稀释倍数。 5.将上述 4 中回收的 DNA 作为阳性对照品,标明 DNA 浓度,分装于 EP 管中,-20℃以下保存。

二、探针的制备
1.取标准 DNA 约 1?g 加灭菌水至终体积 16μl。 2.变性:沸水浴煮 10min,立即冷却 2min。 3.取 Via1 4μl 加到变性的 DNA 中,混合均匀,放入 37℃温箱中放置 过夜。 4.次日, 取出 3, 向其中加入 2.0μl 0.2M EDTA(PH8.0), 2.5μl 3M(PH5.2) NaAc,冰无水乙醇 75μl,-20℃放置 2 小时。 5.取出 4,4℃ 12500rpm 离心 15min,轻轻倒掉上清。 6.加入 70%乙醇约 150μl,缓慢晃动,4℃ 12500rpm 离心 15min,弃 掉上清。 7.室温晾干。 8. 加入 50μl TE(PH8.0),吹打管底,放于-20℃保存,作为探针。

三、探针效力的检测
1.样品及标准品稀释: Vial 2 标准品, 取 用稀释液将其稀释为 10pg/ul、 3 pg/ul、1 pg/ul、0.3 pg/ul、0.1 pg/ul、0.03 pg/ul、0.01 pg/ul。探针 稀释同标准品。 2.点样:将稀释后的样品及标准品分别取样 1ul 点至尼龙膜上。 3.固定:将点样后的膜,放置干燥箱中,80℃ 2h 。 4.封底:在 10ml 中 blocking solution(用马来酸溶液将 Vial 6 做 10 倍 稀释,即 blocking solution)中孵育 30min。 5.加入酶结合物:在 antibody solution(用 blocking solution 将 Vial 4 做 5000 倍稀释即 antibody solution)中孵育 30min。

6.洗膜:用 10ml wash buffer 洗 2 遍,15min/次。 7.平衡:在 10ml 检测液中平衡 2min。 8.显色:加入 2ml 新鲜配制的显色液(40 ul vial 5+ 2ml 检测液) ,避 光放置。 9.终止:待理想的斑点显色后,在 50ml 灭菌水中洗 5min,然后比较 探针与标准 DNA 斑点的显色程度,计算 DNA 探针的浓度。 四、测定方法 1.阳性 DNA 的稀释:用 DNA 稀释液将阳性 DNA 对照稀释成 1 pg/ul 、0.1 pg/ul(D2) 、0.01 pg/ul(D3)三个稀释度。 (D1) 2.蛋白酶 K 预处理:
加样量 供试品 D1 D2 D3 阴性 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul 200 ul 2%蛋白酶 K 溶液 2 ul 2 ul 2 ul 2 ul 2 ul 蛋白酶 缓冲液 40 ul 40 ul 40 ul 40 ul 40 ul 4 ul 4 ul 4 ul 4 ul 3%牛血清白 蛋白溶液 加水至终 体积 400 ul 400 ul 400 ul 400 ul 400 ul

上述样品混合后放入 37℃,保温 4 小时。 注:阴性对照为 DNA 稀释液;空白对照为未进行蛋白酶 K 预处理的 TE 缓冲液。 3.提取 DNA: 于蛋白酶 K 预处理的混合液中加入等体积的酚: 氯仿: 异戊醇的混合液(按 25:24:1 的比例混合)抽提,混匀后, 15000rpm,15min 离心,取上层澄清液体于新的离心管中,再加入 0.2V 的乙酸铵(7.5mol/l)和 2V 的冰无水乙醇,12000rpm,离心 10min, 弃上清, 加入 400 ul 冰 70%乙醇, 2 遍, 洗 12000 rpm/5min/

次,倒掉上清,室温晾干,然后加入 200 ul TE 溶解 DNA。 4.点膜:用 TE 缓冲液浸润杂交膜后,将提取后的 DNA、空白对照置 100℃水浴加热 10min,迅速冰浴冷却 2min,以每分钟 8000 转离心 5 秒。然后用抽滤加样器点样于杂交膜(加样量 190 ul) 。置 80℃真 空干烤 1 小时以上。 5.预杂交 5.1 在 42℃预热合适体积的杂交液(Vial 7) (按 10ml/100cm2 膜)。 5.2 将杂交膜在预杂交液中孵育 30min。 6.杂交 6.1 DNA 探针变性:探针(约 500ng/ml) 煮沸 10min,快速冷却 2min。 6.2 杂交液:将变性的探针加入到预热的杂交液(3.5ml/100cm2)中。 6.3 孵育: 倒掉预杂交液, 加入杂交液, 放入 42℃摇床中, 孵育过夜。 7.洗膜 7.1 室温下用液体 A (2ΧSSC; 0.1% SDS)洗 2 次,5min/次。 7.2 65℃下用液体 B(0.5ΧSSC; 0.1% SDS) 洗 2 次,15min/次。 8.封底:在适量(100 ml blocking solution /100cm2 膜)的 blocking solution(用马来酸溶液将 Vial 6 做 10 倍稀释,即 blocking solution) 中,孵育 30min。 5.加入酶结合物: 在适量 (20 ml antibody solution /100cm2 膜) antibody solution(用 blocking solution 将 Vial 4 做 5000 倍稀释即 antibody solution)中孵育 30min。 6.洗膜:在适量(100 ml /100cm2 膜)wash buffer 中洗 2 遍,15min/

次。 7.平衡:在检测液(20 ml /100cm2 膜)中平衡 5min。 8.显色: 加入 2ml 新鲜配制的显色液 (10 ml /100cm2 膜) ul vial 5+ (40 2ml 检测液) ,避光放置。 9.终止:待理想的条带显色后,在 50ml 灭菌水中洗 5min。 10.结果判定:阳性对照应显色,其颜色深度与 DNA 含量相对应,呈 一定的颜色梯度;阴性、空白对照应不显色,或显色深度小于阳性 DNA 对照 D3,试验成立。 将供试品与阳性对照进行比较,根据显色 的深浅判定供试品中 DNA 的含量, 其中成品显色深度应不深于阳 性 DNA 对照 D2,视为合格。

目前存在或尚待解决的问题
1. 阳性对照 DNA 的一致性:由于阳性对照 DNA 为公司内部自己制 备,与国家检定机构比较,可能存在差异,所以为保证检验结果 的准确性,希望国家检定机构可以派发统一的标准品。 2. 样品的前期处理方法:鉴于在样品的预处理过程中(尤其是 DNA 的再次提取) ,DNA 会有损失,难以保证结果的准确性,因此希 望可以有统一的处理方法。 综上所述,希望国家检定机构举办一个培训班,使该实验可以从 实验设备到实验方法都具有统一性, 使企业与国家标准的检定结果的 误差降至最低,保证企业检定结果的准确性。


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