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用色谱法测定废水中四环素类抗生素


第37卷 2009年6月

分析化学(FENxI HuAxuE)
Chine8e

研究报告

第6期
840_844

JoumaI of Analytical Chemi8try

固相萃取.亲水作用色谱法测定废水中四环素类抗生素
张艺 李瑞萍‘ 张兴华 喻玺 黄应平

(三峡大学Alan G.MacDia珊id再生能源研究所,宜昌443002)



要建立了固相萃取(SPE)-亲水作用色谱法(HILIC)测定废水中金霉素(CTC)、强力霉素(Dc)、四环素

(Tc)和土霉素(0TC)4种四环紊类抗生素(Tcs)残留的新方法。水样经0asi8 HLB固相萃取柱净化富集后,采 用以氨基色谱柱及高极性有机溶剂一水相缓冲溶液为流动相的亲水作用色谱法(HILIc)进行分析。对流动相中 缓冲溶液的类型和pH值、离子强度、有机溶剂的浓度以及流速进行了优化,确定了以y(乙腈):
y(6.7 mmoL/L柠檬酸铵缓冲溶液,PH 4.O)=85:15混合液为流动相的最佳条件。本方法具有良好的线性关系 (r>0.999)和重现性(峰面积RsD<1.0%),最低检出限(S/Ⅳ=3)为12~30斗g/L,4种四环素类药物添加水

平在0.5一10斗g/L范围内的标准加入回收率为90.6%一106.5%;相对标准偏差为2.5%一6.2%。本方法 简便、准确、流动相离子强度低,适合于与质谱联用,用于屠宰场污水及医院污水等实际样品检测,结果满意。
关键词

亲水作用色谱,四环素类抗生素,固相萃取,废水







四环素类抗生素(tetracyclines,TCs)作为一类重要的抗感染药物,广泛用于畜牧业及水产养殖业 中,不仅用于动物疾病的治疗和预防,而且作为动物促生长剂使用。其中土霉素(oxytetracycline, OTC)、四环素(tetracycline,TC)、金霉素(chlortetracycline,CTC)及强力霉素(doxycycline,DC)应用最 多。TCs在环境中不易发生生物降解,一旦进入环境就会诱导耐药菌株的产生,威胁人类健康和生态环 境。由于环境中抗生素残留的浓度相对较低,各国纷纷致力于其检测技术的发展与创新。目前,TCs的

残留检测技术主要有HPLC与质谱联用技术¨“1、HPLc/uV/FD检测¨“1及免疫检测技术"川,王良等
以离子液体浮选一光度法检测四环素类抗生素…1。HPLc与质谱联用技术具有很好的灵敏度及选择性, 但价格较昂贵;HPLC/FD需要荧光衍生试剂;免疫检测技术具有成本低、检测快等优点,但用于环境样 品时灵敏度不高。 亲水作用色谱(HILIC)是一种以极性固定相(如硅胶、氨基键合硅胶等)及含高浓度极性有机溶剂 和低浓度水溶液为流动相的色谱模式¨““’,在一些极性药物的分离中具有反相色谱无法比拟的优点。 如流动相组成简单、适合与质谱联用等。本实验考察了在HILIc色谱条件下流动相缓冲溶液的类型及 pH值、离子强度、有机溶剂的浓度及流速对4种TCs分离的影响,并采用固相萃取富集纯化实际环境水 样,为环境样品中Tcs的测定开辟了另一条途径,扩大了亲水作用色谱的应用范围。 2

实验部分
高效液相色谱系统(美国Waters公司),包括watersl瑚600四元梯度泵、wate硌2487双波长紫外检

2.1仪器及试剂 测器,采用Empower瑚2软件进行数据采集与处理;Oasis HLB固相萃取小柱(3 C.。柱(60 mg,waters公司),CIeanen 析纯,实验用水为超纯水。 2.2标准溶液的配制 准确称取0.05


PEP(3 mMO mg,北京艾杰尔科技有限公司);Tc(F1uka公司);

mL/60 mg)和Sep-Pak

OTC、cTC及DC(中国药品生物制品检定所);甲醇和乙腈(色谱纯,美国Tedia公司);其它试剂均为分

OTC、TC、CTC和DC标准品,加入少量甲醇溶解,然后转移到50 mL棕色容量瓶

2008?12—24收穑;2009旬2-23接受 本文系环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金课题(No.KF2008毋5)、湖北省教育厅重点项目(No.D200713008)及三峡大学 博士启动基金资助

?E—mail:mylee0289@163.∞m

万方数据

第6期

张艺等:固相萃取一亲水作用色谱法测定废水中四环素类抗生素

84l

中,用甲醇定容,配制成l g/L的标准储备液,于4℃冰箱中储存备用(不超过1个月)。 2.3水样前处理 污水采集于宜昌市某屠宰场污水出口及某医院废水。水样先用滤纸过滤,除去其中的悬浮物和大 颗粒杂质,再用0.45斗m滤膜过滤。取100 mL滤液,加入50 去离子水活化。水样过柱后,用2
最后用2 mL 0.01
mL
mg

Na2EDTA,用Hcl将pH调至2.5,然

后用Oasi8 HLB固相萃取小柱进行富集纯化。在萃取前,Oa8is HLB固相萃取小柱用3 mL甲醇和3 mL

5%甲醇水溶液清洗小柱,以除去部分有机杂质。减压抽干5

min,

mol/L草酸一甲醇溶液洗脱。洗脱液用高纯氮气吹干后,用0.5 mL流动相定容,密封

冷藏于4℃冰箱中待测。所有操作在24 h内完成,防止TC8降解。
2.4

色谱条件
Kmmasil

100-5NH2色谱柱(250

mm×4.6

mm,5¨m,瑞典Eka Chemicals公司);流动相:y(乙

腈):y(6.7 mmol/L柠檬酸铵缓冲溶液,pH 4.0)=85:15混合液;检测波长:365 nm;流速:
1.0

mL/min;进样量:20斗L;柱温:30℃。

3结果与讨论
3.1

固相萃取条件的优化 为提高分析物的萃取率及尽可能除去干扰物质,研究了3种SPE小柱(Oa8is
HLB、Sep.Pak C。。和

Cleanert

PEP小柱)对TCs的净化效果。由于TCs易与金属离子络合,所以在水样中加入Na,EDTA,

避免其与残留在样品基质中的金属离子配位而降低萃取率。为了得到TC8高回收率,在100 mL空白 水样中加入5斗g/L混合标样。考察了水样pH(2.0、2.5、3.O、4.0)及洗脱液类型和用量对萃取率的影 响。结果表明,Sep—Pak C。。小柱对TCs的萃取率仅为25%一33%,且重现性较差;cleanert PEP小柱对 TC和OTC的萃取率高于90%,但对cTC和Dc的萃取率较低,仅为61%一66%;而亲水一亲酯型的
Oasis

HLB对4种TCs的萃取率均较高。因此,本实验选择Oa8is HLB小柱对样品进行处理。当水样

pH为4.0时,各化合物的萃取率低于75%,水样pH(2.5—3.O)低于TC8的pKa,值(3.0)时,各化 合物的萃取率均大于90%。水样的pH为2.0时,各化合物的萃取率也高于85%。但考虑到TC8在 强酸性条件易降解为脱水产物,所以萃取前将水样pH值调至2.5—3.0。此外,用甲醇作洗脱液时, 溶质从小柱上完全洗脱下来需要5 mL;用2 0.01mol/L草酸甲醇溶液作为洗脱溶剂。
3.2色谱条件的优化
mL 0.01

moL/L草酸一甲醇溶液洗脱时,分析物的萃取率也
mL

较高,由于前者需要的挥干时间长于后者,所以选用2

3.2.1缓冲溶液pH的选择

在亲水作用色谱中,有机溶

剂的含量较高,所以缓冲液的选择受其溶解度的限制。为 了选择合适的缓冲液及获得最佳的分离选择性,分别选用 磷酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、草酸盐缓冲溶液在pH=3.O的 条件下进行了初步实验。结果表明,当用磷酸盐缓冲溶液 时,4种化合物保留时间较长,峰形较差;甲酸盐缓冲溶液 体系中4种化合物分离较差;草酸盐在高含量乙腈中溶解度 稍差;柠檬酸盐缓冲溶液在高含量的乙腈流动相中有较好的 溶解性及一定的缓冲容量,且4种化合物达到了足够的分 离。所以本研究选择柠檬酸一柠檬酸铵缓冲溶液控制流动相 的pH值,并考察了其pH值对TC8分离的影响(图1)。 pH在2.5~6.0范围内,4种化合物的保留值按下列

k 区 圈 隧

f_售芑圆co;co苗出

缓冲液Bu行研pH

图l缓冲溶液pH对四环素类抗生素(TC8)
保留因子(^’)的影响
Fig.1 Effect of buffer pH
on

retention

factor

(后’)of tetmcyclines(TCs) 1.土霉素(“ytetmoycline,OTC);2.四环素(tetmcy— cline,Tc);3.强力霉素(doxycycline,Dc);4,金霉 素(chlonetr∽ycline,cTc)o

顺序递增:CTC<DC<TC<OTC,且随着pH值的增大,所有化合物的保留值均开始增大,达到最大值 后减小,这种现象说明TCs在氨基色谱柱上的保留存在离子交换机理‘12’14 3。pH 2.5~孔0时,化合物 的保留值较小,DC与TC同时被洗脱;而pH在4.0—5.O范围内,各化合物的保留值变化很小,TC8

万方数据

842

分析化学

第37卷

在13 min内达到了很好的分离,相邻两化合物之间的分离度均大于1.5,且峰形对称,重现性好。pH值 为6.O时,虽然目标分析物都能达到基线分离,保留时间较短,但多次重复进样时,各化合物保留值的 重现性较差。本实验选择柠檬酸铵缓冲溶液的pH为4.0。
3.2.2 20.1


缓冲溶液浓度的选择

保持缓冲溶液的pH 4.O,考察柠檬酸铵浓度(6.7、13.2和

mmoL/L)对分离的影响(见图2)。由图2可知,当柠檬酸铵浓度增大时,样品中所有组分的保留

值略有降低,表明溶质与固定相之间存在离子交换作用但很弱。当柠檬酸铵的浓度为6.7 mmol/L时, 测定的重现性好,说明在此色谱条件下,低含量的缓冲液就有足够的缓冲能力,适合于与质谱联用。 3.2.3有机溶剂浓度的选择流动相为乙腈一柠檬酸铵缓冲溶液(6.7 mmo∥L,pH 4.O),考察了流动 相中乙腈浓度(50%一90%,∥y)对TCs保留的影响(图3)。随着乙腈浓度的增加,流动相的极性逐渐 降低,溶质的保留增大。当乙腈浓度增大为85%(∥y)时,相邻两峰之间的分离度均大于1.5;继续增 大乙腈的浓度至90%(∥y)时,各化合物的保留值增大,但DC与TC同时被洗脱,所以流动相中乙腈 的最佳浓度为85%(∥y)。

_

k 2 鼬 毯
f_Y2u匹co—lu∞苗g



塞重 星{



COntentratlOn Ot ammonlum cJtrate

柠檬酸铵苍度(m叩ol/Lj

乙腈比例Prop叭ion ofaceton埘le(%)
图3
retention

图2缓冲液浓度对TCs保留因子(后’)的影响
Fig. 2 Efkct TCs of buffer concent强tion
on

乙腈浓度对TCs保留因子(七’)的影响
Efbct of TCs acetonitrile
concentration
on

Fig.3

retention

factor(后’)of

factor(.|}’)of

3.2.4流速的选择

当流动相为y(乙腈):y(6.7 mmol/L柠檬酸铵缓冲溶液,pH 4.0)=85:15混合

液时,在O.5一1.2 mL/min范围内,考察了流动相流速对柱效及分离度的影响。结果表明,在此流速 范围内,各组分的峰形对称,相邻两组分间均达到了基线分离。流速降低,各峰之间的分离度增大, 柱效提高,但分析时间延长;而提高流速可以缩短洗脱时间,但由于流速过高会增加柱压,不利于色 谱柱的长期使用。兼顾分离时间、柱效及分离度,本实验选择1.O mL/min为最佳流速。 根据以上实验结果,确定了最佳色谱条件:y(乙腈):y(6.7 mmoL/L柠檬酸铵缓冲溶液,
pH

4.O)=85:15混合液为流动相,流速1.0 mL/min。在此色谱条件下,TCs的混合标样色谱图如图4

所示,4种组分的理论塔板数均高于104,相邻两组分之间的分离度>1.5,各组分色谱峰拖尾因子<1.1。 3.3线性范围、检出限、重现性和回收率 将标准储备液用流动相稀释,配制成一系列浓度 梯度的混合标准系列溶液。CTC、Dc和TC在0.05—
10

mg/L范围内与其峰面积呈良好的线性关系,OTc的

线性范围为O.1—10 mg/L,r>0.999。以3倍信噪比 (S/Ⅳ=3)求得CTC、DC、TC和OTC的检出限见表1。 配制0.1、1和5 mg/L标准溶液,分别连续进样7次,
O 2 4 6 f,min 8 lO 12 14

保留时间、峰面积和峰高相对标准偏差(RSD)均小于 1.0%,重现性较好。 取不含目标抗生素的空白水样100 mL,分别配制 低、中、高3个浓度水平(0.5、2.5和10.O“g/L)的样品溶
图4
Fig.4

Tc8标准样品色谱图
Chmmatogmm of 4 TCs standards

液,按照2.3和2.4项的方法进行萃取和测定,计算方法的回收率与精密度(见表2)。从表2可知,本方

万方数据

第6期

张艺等:固相萃取一亲水作用色谱法测定废水中四环素类抗生素

843

法的平均回收率为90.6%一106.5%‘;相对标准偏差为2.5%~6.2%,说明本方法具有很好的准确度 和精密度。
表1
Table


线性回归方程、相关系数、线性范围和检出限
Regression

equation,correlation coemcient,Iinear

range

and detection limit

x:样品浓度(concen№ti∞of

tIle

sa“ple),mg/L;y:样品峰面积(Peak

ama

o“he sample)。

表2水样中4种四环素类抗生素的加标回收率与相对标准偏差(n=5)
Table 2 Recoveries and relative standard

devia“ons(RsD)of TCs

in

spiked

water(,I=5)

3.4实际样品分析

采集了宜昌市某屠宰场的出口废水及医院废水,按照2.3和2.4项的方法进行预处理和测定,结 果在医院废水中未检出TCs,而在屠宰场废水中4种TCs均被检出(见图5),测得CTC、DC、TC及OTC 的浓度分别为O.25、0.28、O.30及0.55¨g/L;RSD为4.4%~7.6%(,l=3)。在上述废水中添加 O.3斗g/L标准混合样,测得4种TCs的回收率为86.7%一113.3%;RsD为3.8%一9.4%(,l=3)。
2?O 3.O l?5 3 3 《 g 2.O

{1.o
O?5

1.O

0.O O 2

O.O







10

12

14

16

18

20











lO

12

14

16

18

f,min

f/min

图5屠宰场废水的色谱图
Fig.5 Chromatogmm8 of abattoir
abattoir wastewater

a.屠宰场污水原样(积ginal
with

wastewater);b.屠宰场污水添加0.3恤g/LTC8(abat协irw∞tewateT 8piked

0.3肛g/LTcB)。1.TCT;2.DC;3.TC;4.OTc.

Refbrences
l 2 3 4 Ye z

Q,weinberg H S,Meyer M T.A聘aZ.C_IIem.,2007,79(3):1135一1144

Pet∞v诞M。Hemando M D,DI此一cnlz M S,Barcel6 D.上(冼romd£ogr.A,2005,1067(1/2):1一14
Ben

w w,Qiang z M,Adams C,zhang



Q,Chen L P.正c^rDm口£D鲁.r.A,2008,1202(2):173_180

“Rui?Ping(李瑞萍),zhang Yi(张艺),Huang Ying-Ping(黄应平).Prog.Ckm.(化学进展),2008,20(12):
2075~2082

5 6

BabfS,A蓉perger D,Mutavd酣D,Horvat A J M,Ka菩telan-Macan
Hu

M.zh缸,l缸,2006,70(4):732~738

Guan-Jiu(胡冠九),Wang Bing(王冰),Sun cheng(孙成).En口拍n.clIIem.(环境化学),2007,26(1):

106_107 7 Liu

Hong(刘虹),zhang Guo-Pi“g(张国平),Liu

Cong—Qiang(刘丛强).傩i聊e工AMz.Ckm.(分析化学),2∞7,

35(3):3lS-319

万方数据

844

分析化学
xian-Gang(胡献刚),Luo Yi(罗义),zhou Qi—xing(周启星),xu

第37卷



Hu

Lin(徐琳).miMe上A,l口Z.傩伽.(分析化

学),2008,36(9):1162—1166
9 10 ll Yang S,C8r180n K.IFkter Re豇,2004,38:3155~3166 Kumar K,Thomp80n A,Singh A K,chander Y,Gupta S

C.上E,ⅢirD,1.Qu口zit),,2004,33(1):250_256

wang Liang(王良),Yan Yong-sheng(闫永胜),zhu Wen-Shuai(朱文帅),“Hua—Ming(李华明).傩fⅢ蝤e^A,l口f.

傩em.(分析化学),2009,37(1):72—76
12 13 14

“Rui—Ping(李瑞萍),Huang Jun-xiong(黄骏雄).PrDg.m绷..(化学进展),20%,18(11):1508一1513
Hem8tr m P,Irgum

K.上S印.Sc丘,2006,29:1784—182l

Ikegami T,Tomomatsu K,Takubo H,Horie K,Tanaka N.上C^rD,,l口驰冒r.A,2008,1184:474~503

Solid Phase Extraction-Hydrophinc Interaction Chromatographic

Determination of Tetracycline

AntibiOtics in

Wastewater

ZHANG Yi,LI Rui-Ping‘,ZHANG Xing—Hua,YU Xi,HUANG Ying?Ping

(A如n G.肘ⅡcDi。rm掘尺esenrc^,,lstnⅡte矿Rene埘口6如E厅er昌y,C^i,l口弛旭e

GD,兽脚踟眈rsil,,,,%_IIo,lg 443002)
i.e.

Abstract

A novel

method for

the

dete珊ination

of tetmcycline

antibiotics(TCs),

oxytetracycline

(OTC),tetracycline(TC),chlonetracycline(CTC) and doxycycline(DC)in

wastewater

sample by hydm-

philic interaction chromatography(HILIC) using amino—silica column with highly polar organic—aqueous buf艳r
as

mobile phase has

been deVeloped.

TCs were
as

collected

and

purified

fI.om

wastewater

using

Oasis

HLB

cartridges. and now

Separation parameters such have been optimized.

the bufkr pH,buffer ionic strength,organic modifier concentration mmol/L

rate

The optimal mobile phase was 85%(I,/y)acetonitrile in 6.7

ammonium citrate buf伯r(pH 4.0).The developed method had good linearity(r>0.999)and reproducibility

(RSD<1.0%for the peak area). The limits of detection for the TCs tested (S/J7、r=3).Recoveries of TCs
at

were

between

l 2—30斗g/L

the concentration of 0.5一10斗g/L ranged from 90.6%to 106.5%with

RSD 2.5%一6.2%.The proposed method i8 simple,accurate and the mobile phase is compatible for mass
specn.ometry wastewater

due

to

its low

ionic

strength.

It

has

been

applied

to

the

dete瑚ination

of TCs

in

abattoir

samples with satisfactory results. Hydrophilic samples
(Received
24 December 2008;accepted 23

Keywords
wastewater

interaction

chromatography,

tetracycline

antibiotics,

80lid

phase

extraction,

Febmary 2009)

::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::::;:::::::::::::::::::::::::::::

《颗粒分散科学与技术》
该书从胶体化学、表面(界面)化学理论、材料学及颗粒技术出发,系统地介绍了颗粒的性质、颗粒间的相互作用、颗 粒表面改性、颗粒在不同介质中的分散理论、分散特征、分散方法与技术。该书对分散剂、分散的评价方法、典型设备以 及分散技术的应用等也作了介绍。 该书系统地总结国内外有关颗粒分散技术的最新研究成果和生产实践,以促进超细颗粒技术及其相关工业的发展, 有助于相关行业人员加深和拓宽对颗粒分散这门多学科、跨行业的新兴综合性科学技术的理解。 该书对超细颗粒加工和颗粒分散相关行业和学科感兴趣的科技工作者参考。 该书由任俊、沈健、卢寿慈著,化学工业出版社出版,定价28.00元。

万方数据

固相萃取-亲水作用色谱法测定废水中四环素类抗生素
作者: 作者单位: 刊名: 英文刊名: 年,卷(期): 被引用次数: 张艺, 李瑞萍, 张兴华, 喻玺, 黄应平, ZHANG Yi, LI Rui-Ping, ZHANG Xing-Hua , YU Xi, HUANG Ying-Ping 三峡大学Alan G. MacDiarmid再生能源研究所,宜昌,443002 分析化学 CHINESE JOURNAL OF ANALYTICAL CHEMISTRY 2009,37(6) 0次

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