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山西褐马鸡种群的遗传多样性初探


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山西省褐马鸡种群的遗传多样性初探1
常江,吴爱平,张正旺
北京师范大学生物多样性与生态工程教育部重点实验室,生命科学学院,北京(100875)
E-mail:cjfloating@163.com

摘 要: 褐马鸡现存种群和数量都正在大幅度减少。 本文测定和比较褐马鸡主要分布区山西 省的 78 只褐马鸡个体的线粒体控制区(mtDNA CR)序列(478bp),发现仅有 1 个单核苷 酸突变位点,定义了 2 个单倍型(H1,H2)。其中 H1 为主要单倍型,现行分布广泛,占研 究个体总数的 93.6%,另一个单倍型 H2 由 H1 发生突变形成,占研究个体总数的 6.4%。山 西省褐马鸡种群的平均核苷酸多样性指数(π)和单倍型多样性指数(h)极低,分别为 0.2168 和 0.0006。结果提示,山西省现存褐马鸡种群的线粒体遗传多样性极低,单倍型数量极少是 褐马鸡分化成种后经历过严重的瓶颈效应,母系数量锐减和现行人为破坏影响的结果。 关键词:褐马鸡,mtDNA,控制区,瓶颈效应

1. 引言
褐 马 鸡 (Crossoptilon mantchuricum) 为 我 国 Ⅰ 级 重 点 保 护 动 物 , 隶 属 于 鸡 形 目 (Galliformes)雉科(Phasianidae)马鸡属(Crossoptilon),为我国特有种[1][2],分布于山西西 北部、陕西省黄龙山、河北西北部及北京门头沟地区[3](图 1)。在各分布区内褐马鸡的栖 息地环境破坏严重,尤其是在山西许多地区普遍存在开采煤矿、铁矿等人为干扰,对褐马鸡 的生存极为不利[4][5],再加上森林退化加剧,褐马鸡的栖息地大幅度片段化,导致褐马鸡的 种群数量锐减。以往对褐马鸡的研究包括:分布现状[6]、种群数量调查[7][8]、窝卵数及其变 异[9]、后肢肌肉的比较研究[10]、巢址选择[11]、繁殖生物学[12]、集群行为[13]、取食及梳羽等 行为观察[14]、年活动规律[15]、笼养褐马鸡冬季社群等级[16]、核型及染色体 G 带带型[17]以及 其分类地位的讨论[18][19]等。但随着褐马鸡种群和数量的锐减,研究和掌握现存种群的遗传 多样性对于该物种的保护就尤为重要。 本文利用 mtDNA 控制区(control region)的高变序列研究山西省褐马鸡的种群遗传多 样性,并就褐马鸡山西种群在进化过程中的历史动态进行初探。

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本课题得到教育部科技重点项目(No.03012)和国家自然科学基金重点项目(No.30330050)的资助。 -1-

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图 1 褐马鸡的分布:(1)黄龙山;(2)神池县;(3)芦芽山国家级自然保护区;(4)兴县;(5)静 乐县;(6)岚县;(7)娄烦县;(8)阳曲县;(9)临县;(10)古交县;(11)庞泉沟国家级自然保 护区;(12)离石县;(13)文水县;(14)中阳县;(15)汾阳县;(16)孝义县;(17)石楼县;(18) 交口县;(19)汾西县;(20)五鹿山国家级自然保护区;(21)大宁县;(22)吉县;(23)临汾县; (24)乡宁县;(25)稷山县;(26)张家口市;(27)涿鹿县;(28)小五台山国家级自然保护区;(29) 蔚县;(30)涞水县;(31)涞源县;(32)东灵山 (引自 《亚洲鸟类红皮书》) ○历史分布(1950 年以前)●分布现状(1980 年至今)□未知年份

2. 材料和方法
2.1 样品来源
所得样品共 78 个,包括羽毛样品 58 个、血液及肌肉样品 20 个,来源于山西芦芽山自 然保护区、山西五鹿山自然保护区和山西庞泉沟自然保护区。

2.2 DNA 提取
羽毛总 DNA 的提取方法参见[20];血液总 DNA 的提取方法参考[21]的方法并做适当修改。

2.3 PCR 扩增、产物纯化及测序
控制区扩增及测序引物见[22]。 PCR 反应体系为 25?l。 其中含 DNA 模板约 30ng, 引物各 0.5?mol, 酶 0.625 U (Takara, Taq Japan), MgCl22 mmol/L (Takara), dNTP 各 0.2 mmol/L (Takara) 和 1×PCR Buffer (Takara)。 PCR 反应条件为:94℃预变性 5min,然后进行 40 个循环(94℃变性 30s,55℃退火 20s, 72℃延伸 30s)最后 72℃延伸 10min。 , PCR 反应在 PTC—200 型热循环仪 (MJ Research, Inc. USA) 上进行,操作过程设空白对照。PCR 产物经 1%的琼脂糖( PROMEGA, USA)凝胶电泳 检测后,切割目的条带,用 Gel Extraction Mini Kit (Watson Biotech , China)纯化回收。应用 ABI Prism BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit ( Applied Biosystems
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Inc.,USA) 进行测序反应。DNA 测序在北京华大中生科技发展有限公司的自动测序仪 ABI PRISMTM 3730 上进行。

2.4 DNA 序列及系统发育分析
DNA序列利用Chromas(V1.45)软件进行人工校正,并采用SeqEdit(Applied Biosystems Inc. , USA)软件进行对比拼接,再使用CLUSTAL X 软件进行DNA序列排列。研究中采用 MEGA 2.1[23]的Kimura双参数法分析各单倍型之间的遗传距离。利用Arlequin (2.000) [24]计算 各地理单元内单倍型多样性( h) 和核苷酸多样性(π)。

3. 结果
我们成功扩增并测序了线粒体 DNA 控制区 5’区高变部分的 478bp。在所有 478bp 的序 列中,无插入/缺失,定义了 2 个线粒体 DNA 单倍型,各采样地间存在一共享单倍型 H1 (Haplotype 1)。

3.1 种群遗传多样性
分析表明,山西省褐马鸡种群的单倍型多态性(h)较低,为 0.2168;核苷酸多态性(π) 也均较低,为 0.0005。

3.2 单倍型间和外群间的系统发生关系
只有1个单核苷酸位点的突变,无简约信息位点,以蓝马鸡(C. auritum)为外群构建的 各单倍型间的NJ树表明单倍型H1与蓝马鸡单倍型金进化关系,为较古老单倍型,现行分布 广泛,占研究个体总数的93.6%;H2是由H1发生突变形成,占研究个体总数的6.4%。

3.3 褐马鸡的种群结构
把采样点, 即山西芦芽山自然保护区、 山西五鹿山自然保护区和山西庞泉沟自然保护区 分别作为单个地理种群进行分子变异分析(AMOVA)表明, 遗传差异主要发生在地理单元间, 占 69.53%,而单元内只有 30.47%。

4. 讨论
遗传多样性是物种长期进化过程中对环境变化产生的一种适应, 在一定程度上反映了物 种的进化潜力[25][26]。反映遗传多样性的指标有多态性位点数、单倍型数、核苷酸多样性指 数(π)、单倍型多样性指数(h)等。本研究中,我们发现山西省褐马鸡种群的单倍型数量 及多态性位点均偏少,在一定意义上反映出褐马鸡种群的遗传多样性水平较低。另外,褐马 鸡种群的核苷酸多样性指数(π)和单倍型多样性指数(h)与其他濒危鸟类相比,数值均远 低于其它物种[27][28],一定程度上也反映了褐马鸡种群的遗传多样性水平极低。 值得注意的是,在陕西省褐马鸡种群的两种单倍型中,H1 在几个地理种群中均有分布, 且与外群蓝马鸡的遗传距离最小(0.0042),而单倍型 H2 与 H1 是由于单核苷酸突变而形 成的,这表明单倍型 H1 是褐马鸡种群中最原始的单倍型,并且是山西省褐马鸡种群在经历 过历史上严重的瓶颈效应后的幸存母系, 也是山西省现存褐马鸡种群的主要奠基者; 而单倍 型 H2 是由单倍型 H1 突变进化形成。另外,依据单倍型之间的遗传距离,如果采用通用分 子钟即每百万年发生 2%的碱基突变速率[29]计算,两个单倍型的分化约在 10 万年左右。 山西省褐马鸡种群的遗传多样性较低,我们分析可能有以下两方面原因:(1)褐马鸡 大约在 20 万年前分化成种[30],此后由于冰期作用使其经历了严重的瓶颈效应,导致褐马鸡
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的母系经历了数量的剧烈锐减, 少量的母系奠基者使得种群的单倍型水平起点就极低; (2) 近现代以来, 山西省现存各分布区内褐马鸡的栖息地环境破坏严重, 尤其是在山西许多地区 普遍存在开采煤矿、铁矿等人为破坏,对褐马鸡的生存极为不利,同时周边森林退化加剧, 使得褐马鸡的栖息地片段化严重,故而褐马鸡的种群和数量都大幅度锐减。这样,在遗传多 样性起点低,又没有大量的有效种群作为缓冲的情况下,由于遗传漂变的缘故,就导致山西 省褐马鸡种群的 mtDNA 遗传多样性匮乏的现状。 由于山西省是现存褐马鸡分布的主要地区, 该地区褐马鸡种群的遗传多样性的匮乏也就 基本代表了褐马鸡种群目前所面临的濒危现状, 希望能引起保护工作者的进一步关注和重视 并采取必要的保护措施。

5. 致谢
感谢山西省林业厅和山西省芦芽山国家级自然保护区、 五鹿山国家级自然保护区和庞泉 沟国家级保护区提供样品。

参考文献
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A pilot study about population genetics of Crossoptilon mantchuricum in Shanxi province
Chang Jiang, Wu Aiping, Zhang Zhengwang
Ministry of Education Key Laboratory for Biodiversity Sciences and Ecological Engineering; College of Life Sciences, Beijing Normal University, Beijing (100875) Abstract Population of Crossoptilon mantchuricum in Shanxi is declined sharply. We sequenced and analyzed mtDNA CR sequences of 78 individuals of Crossoptilon mantchuricum to assess the genentic diversity of Shanxi populations. Data shows there are only two haplotypes in studied populations. The haplotype 1 is dominant (93.6%) in studied populations, the haplotype 2 is only 6.4%. The extent of genentic diversity of h and π is very low. The former is 0.0006, the latter is 0.2168. Results indicate populations must have experienced severe population bottlenecks. Keywords: Crossoptilon mantchuricum, mtDNA, CR, population bottleneck

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