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HPLC指纹图谱在中药及民族药品质评价中的应用_图文

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成都中医药大学学报 Journal of Chengdu University of TCM

中药研究

HPLC 指纹图谱在中药及民族药品质评价中的应用
古锐1   张艺1   王平1   邓科君2

Abstract :The article briefed the characteristic of HPLC fingerprints , considered it to be useful to study on evaluation of Chinese traditional medicine and ethnomedicine. The article took examples for ethnomedicine (fructus Choerospondiatis , herba Pterocephali , fructus Hippophae) and genuine Rhizoma Chuanxiong produced in Sichuan , adopted the method of stechiometry , illuminated HPLC fingerprints application , which use for species identify , identify of the part for medicine , process in producing area and analysis of genuine characteristics. Key Words :HPLC fingerprints ; evaluation ; Chinese traditional medicine ; ethnomedicine

     : 叙述了高效液相指纹图谱的特点 , 认为其在中药及民族药品质评价方面具有优势 。以民族药 摘 要 广枣 、翼首草 、沙棘及川产道地药材川芎为例 , 采用化学计量学等方法 , 用具体试验说明 HPLC 指纹图谱 在药材品种鉴定 、药用部位鉴定 、产地加工及道地特征分析 4 个方面的应用 。 关键词 : 高效液相指纹图谱 ; 品质评价 ; 中药 ; 民族药 中图分类号 : R28411 ; R917     文献标识码 : A 文章编号 : 100420668 ( 2006) 0220040206

Application of HPLC Fingerprints to Study on Evaluation of Chinese Traditional Medicine and Ethnomedicine
GU Rui , ZHANG Y , WANG Ping , D ENG Ke - jun i
(11Pharmaceutical college ,Chengdu University of TCM ,Chengdu 610075 ,China ; 21College of Life Science and Technology , UESTC ,Chengdu 610054 ,China)

   色谱指纹图谱技术发轫于二十世纪七十年代 , 国外始用该方法监控植物原料药 、 植物药产品质量 , 因其具有整体性和模糊性的基本属性 , 能反应物质 特征 “完整全貌” 特别适合于中医药传统理论研究 , 的需要 。2000 年国家药监局颁发了 《中药注射剂指 纹图谱研究的技术要求 ( 暂行) 》上述文件规范了指 , 纹图谱用于中药制剂质量控制的细则 , 使中药色谱 指纹图谱研究方兴未艾 。 作为中药常规鉴定技术的延伸 ,在现阶段 ,色谱 指纹图谱的作用主要是将常规的单一指标成分或活 性成分作为质量指标的方法提升到一个新阶段 , 用 色谱的指纹特征 , 通过量化参数并结合化学模式识 别进行整体性评价 ,可以有效的分析中药品种品质 ,

(11 成都中医药大学 药学院 , 四川 成都   611730 ; 21 电子科技大学生命科学与技术学院 , 四川 成都   610054)

1

1

1

基金项目 : 国家创新药物和中药现代化项目基金资助 ( 项目编号 : 2003AA2Z3248) 作者简介 : 古锐 , 男 , 1979 年生 ; 助教 ; 研究方向 : 民族药的可持续开发与利用 。

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鉴别药材真伪优劣 ,寻找不同品种间化学特征差异 , 分析道地药材化学特征 , 判别用药部位及产地加工 方法等 。在上述研究中 , 高效液相指纹图谱通过其 分离效能高 、 分析速度快 、 模块化及可联用等特点 , 可以得到丰富化学信息 , 并能结合化学计量学等方 法对数据进行综合分析 ,因此研究最为广泛 。 我们以民族药广枣 、 翼首草 、 沙棘及川产道地药 材川芎为例 ,从药材品种鉴定 、 道地特征分析 、 用药 部位鉴定及产地加工 4 个方面对 HPLC 指纹图谱技 术应用进行分析 。 1  HPLC 指纹图谱研究用于民族药广枣品种鉴别 广枣为漆树科南酸枣属植物南酸枣 Choerospon2 dias axillaries ( Roxb1) Burtt et Hill . 的干燥成熟果实 ,
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2006 年 6 月第 29 卷第 2 期 Jun12006 , Vol129 , No12

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第2期

古锐等  HPLC 指纹图谱在中药及民族药品质评价中的应用

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[1 ] binervis ( Rdhd1 Et Wils 1) Burtt et Hill 。藏医院习

用的广枣药材来源较为复杂 , 因此我们采用 HPLC 指纹图谱技术寻找两者间化学成分差异以期鉴别药 用广枣品种 。 111   仪器与样品
Waters 2695 高效液相色谱仪 ,Waters 2996 检测 器 ( DAD ) , Empower pro 工作站 ; 供试样品为南酸枣 112   实验方法
时间 (min)
0~25 25~50 50~60 60~65

11211   色谱条件

1 ,检测波长 :254 nm ,360 nm 。
流动相 (A %)
100 100 → 75 75 → 20 20 → 0

11212   对照品及供试品溶液的制备

为藏 、 蒙族常用药 , 主产于我国广东 、 广西 、 江西等 省 。四 川 地 区 大 量 分 布 的 为 其 变 种 毛 脉 南 酸 枣 Choerospondias axillaries ( Roxb1) Burtt et Hill var. pu2 湖南省益阳县 ) , 毛脉南酸枣 Choerospondias axillaries ( Roxb1) Burtt et Hill var1 pubinervis ( Rdhd1 Et Wils 1) Burtt et Hill ( 产地 : 四川省) 。
表1  流动相梯度条件 流动相 (B %)
0 0→ 25 25 → 80 80 → 100

锥形瓶中 ,精密加入 50 %甲醇 20 mL , 称定重量 , 超 声处理 1 h , 放冷 , 用 50 %甲醇补足损失的重量 , 滤 过 ,取续滤液作为供试品溶液 。
11213   测定方法

色谱柱 :Diamonil C18 ( 250 mm × 16 mm) ,5 μ ; 4 m 流动相 :A 、11 %磷酸溶液 ,B 、 0 甲醇 , 梯度条件如表 精密称取没食子酸和原儿茶酸对照品适量 , 置 于 100 mL 棕色量瓶中 , 以甲醇溶解并稀释至刻度 , 作为对照品溶液 。   本课题组采用 HPLC 指纹图谱 , 对川产道地药 材川芎道地性化学特征进行分析 , 选取了川芎副产 取样品粉末 110 g , 精密称定 , 置于 50 mL 具塞

Choerospondias axillaries ( Roxb1) Burtt et Hill1 ( 产地 :

( 上为毛脉南酸枣样品色谱峰 ; 下为对照品色谱峰)

图 1   nm 检测波长下对照品溶液与毛脉南酸枣比较 254

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缺失或明显低于南酸枣 , 如图 1~图 3 。 11313   上述试验提示南酸枣与毛脉南酸枣差异部 位在于其总黄酮部位 , 可以在加大实验样本的基础 上 , 设定该部位含量限度以区分两个品种 。 2  HPLC 指纹图谱研究用于川芎道地性化学特征分 析 “道地药材”是一个约定俗成的对古代药物品 质评价的概念 , 是人们传统公认的 、品质优良 、疗 效确 切 且 产 生 于 特 定 生 态 地 理 环 境 的 一 类 中 药 材 [2 ] 。 通过指纹图谱技术可以将道地药材化学成分特 征与影响药材生长的因素联系 , 通过建立药材化学 特征指纹图谱 、基因指纹图谱及外观特征指纹图 谱 , 从有效成分和遗传物质两方面寻找药材道地性 的物质基础 , 分析鉴别道地药材的形成模式 , 寻找 影响道地药材质量的因素 。
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精密吸取上述供试品溶液 20 μ ,注入高效液相 L 色谱仪 ,测定 。 113   结果分析 11311   根据 HPLC 指纹图谱中色谱峰紫外特征及文

献报道判断 ,色谱中主要反映的化学成分为多元酚 ( 色谱图前 30 min) 及黄酮类 ( 色谱图 30~50 min) 。 11312   从谱图上可以发现 , 南酸枣和毛脉南酸枣 多元酚种类基本一致 , 但在 35~55 min 之间 , 黄酮 类成分区别较大 , 部分毛脉南酸枣样品该段色谱峰

物山川芎 、 奶芎和不同产地川芎样本 ,对所得的结果 进行主成分分析 ,并由此判断川芎道地性化学特征 。

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成都中医药大学学报

2006 年第 29 卷

μ ; 流动相 : A 、011 %磷酸溶液 , B 、甲醇 , 梯度 m 条件如表 2 , 检测波长 : 280 nm 。
表2  流动相梯度条件 流动相 (A %)
65 65 → 20 20 → 0

取川芎药材粉末 015 g , 精密称定 , 置圆底烧 瓶中 , 加入甲醇 20 mL , 水浴回流 60 min , 取出 , 放冷 , 转移至 25 mL 容量瓶中 , 加甲醇稀释至刻 度 , 摇匀 , 作为供试品溶液 。用微孔滤膜 ( 0145 μ ) 过滤后 , 备用 。 m
21213   测定方法

211   仪器与样品 21211   色谱条件
时间 (min) 0~5 5~40 40~60

岛津 LC - 10A 高效液相色谱仪 , SPD - 10Avp 可见紫外检测器 ( 日本 ) , N - 2000 色谱数据工作

( 上为南酸枣色谱峰 ; 下为毛脉叶南酸枣色谱峰)

图 2   nm 检测波长下南酸枣与毛脉南酸枣比较 254

( 第一条色谱图为南酸枣色谱图 , 其余均为毛脉南酸枣色谱图)

图 3   nm 检测波长下南酸枣与毛脉南酸枣总黄酮成分比较 360

21212   供试品溶液的制备

色谱柱 : Diamonil C18 ( 250 mm ×416 mm) , 5
流动相 (B %)
35 35 → 80 80 → 100

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站 ; 供试样品为道地川芎 、道地川芎副产物及栽培 变种 ( 江西抚芎) , 共计 37 批 。 212   实验方法 有相关性 。
SAS 610 软件计算 , 得第 1 主成分方差贡献率为
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精密吸取上述供试品溶液 20 μ , 注入高效液 l 相色谱仪 , 测定 。色谱图如图 4 所示 。 213   结果分析 通过对样本特征矩阵进行主成分分析 , 运用

97165 % , 第 2 主成分方差贡献率为 1123 % , 两个

主成分累计方差贡献率为 98189 % , 大于累计贡献 率 85 %的要求 , 说明 2 个主成分足以概括样本中的 原始信息 。各代表类型样本在主成分投影图中分布 如图 5 所示 。 由图 5 可见 , 山川芎 、奶芎和抚芎单独聚成一 类 。由第一主成分变化趋势与供试品色谱峰面积比 较发现两者变化趋势一致 , 由此分析川芎道地性与 特征化学指纹图谱所表达的药材次生代谢产物含量

第2期

古锐等  HPLC 指纹图谱在中药及民族药品质评价中的应用

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图4  川芎指纹图谱及共有峰标示

图5  不同代表类型川芎在主成分投影图中的分布

3  HPLC 指纹图谱用于藏药翼首草不同药用部位化

学成分差异研究 藏 药 翼 首 草 为 川 续 断 科 匙 叶 翼 首 草 Ptero2 cephalus hookeri ( C1 B 1 Clarke ) Hoeck1 全草 。主要含 有皂苷类 、环烯醚萜类 、黄酮类物质 , 翼首草药材 及其制剂的质量评价多以 HPLC 测定药材中熊果 酸 、齐墩果酸 。前期研究证明 , 翼首草地下部分 (根及根茎 ) 与地上部分 ( 叶 、花 ) 熊果酸 、齐墩 果酸 含 量 存 在 差 异 [3 ] 。本 课 题 在 此 基 础 上 建 立 HPLC 指纹图谱 , 研究翼首草根与地上部分其他成 分差异 。 311   仪器与样品 岛津 LC - 10A 高效液相色谱仪 , SPD - 10Avp 可见紫外检测器 ( 日本 ) , N - 2000 色谱数据工作 站 ; 试验中将产于青海的翼首草其分为地上部分与 地下部分 。

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312   试验方法 31211   色谱条件
时间 (min) 0~10 10~45 45~60

色谱柱 : Alltech Apollo C18 ( 250 mm × 16 mm) , 4 5 μ ; 流动相 : A 、015 %磷酸溶液 , B 、甲醇∶ m 乙腈 ( 50∶ ) , 梯度条件如表 3 , 检测波长 : 254 nm 。 50 31212   供试品溶液的制备 取样品粉末 310 g ( 过一号筛) , 精密称定 , 置 圆底烧瓶中 , 精密量取 50 mL 甲醇水浴回流 2 h , 取出放冷 , 用甲醇补足减失的重量 , 摇匀 , 过滤 , 滤液作为供试品溶液 。精密吸取供试品溶液 20 μ , L 注入液相色谱仪 , 测定 。
表3  流动相梯度条件 流动相 (A %)
80 80 → 50 50 → 0

流动相 (B %)
20 20 → 50

50 → 100

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成都中医药大学学报

2006 年第 29 卷

药材的产地加工及其储藏运输对药材质量影响 较大 , 通过应用 HPLC 指纹图谱 , 可以反映药材在 上述过程中的变化情况 。 沙棘药材为胡颓子科植物沙棘 Hippophae rham2 noides L1 及其同属植物的干燥果实 。被广泛用于活 血散瘀 、止咳祛痰 、消食化滞 , 在多个成方制剂中 使用 。本试验采用 HPLC 指纹图谱分析沙棘原生药 材和提取醋柳黄酮用原料药材间总黄酮部位的差 异 , 分析产地加工及储存因素对沙棘质量的影响 。 411   仪器与样品 岛津 LC - 10ATVP 高效液相色谱仪 , SPD - 10 Avp 可见紫外检测器 ( 日本) ; N - 2000 色谱数据工 作站 ; Waters 2695 高效液相色谱仪 , Waters 2996 检 测器 (DAD) , Empower pro 工作站 ; 样品包括 22 批 沙棘生药材 ( 编号 : A1 ~A22 ) , 18 批提取醋柳黄酮 用沙棘原料药材 ( 编号 : B1~B18 ) 。 412   试验方法

313   结果分析 31311   由色谱图 6 、 7 可知 ,翼首草地上部分 ( 叶 、 图 花) 与地下部分 ( 根及根茎) 差异明显 ,地上部分成分 较多 ,但地下部分 23 ~ 32 min 处色谱峰较地上部分 4  HPLC 指纹图谱用于分析药材产地加工等影响因素

图6  翼首草地上部分 ( 叶 、花) HPLC 指纹图谱

图7  翼首草地下部分 ( 根及根茎) HPLC 指纹图谱

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41211   色谱条件 色谱柱 : Diamonil C18 ( 250 mm ×416 mm) , 5 μ ; 流动相∶ 、011 %磷酸溶液 , B 、甲醇 - 四氢 m A 呋喃 - 异丙醇 ( 8 ∶∶13) , 梯度条件见表 4 , 检测 2 0 波长 : 360 nm 。 41212   供试品溶液的制备 取沙棘粉末 015 g , 精密称定 , 置圆底烧瓶中 , 分别加入甲醇溶液各 40 mL , 80 ℃ 水浴加热回流提 取 30 min , 取出 , 放冷 , 转移至 50 mL 容量瓶中 , 加甲醇至刻度 , 摇匀 , 作为供试品溶液 。精密吸取 供试品溶液 20 μ , 注入液相色谱仪 , 测定 。 L
表4  流动相梯度条件 流动相 (A %)
97 97 → 75 75 → 45 45 → 35 35

高 ,在此时间段内 ,两者含量差异明显 。 31312   可以考虑加大样本数量 , 确定鉴别地上部 分与地下部分的特征性化学成分 , 如以 30 min 色谱 峰作为地上和地下部分的鉴别特征 。
时间 (min)
0~3 3~20

流动相 (B %)
3 3→ 25

20~35 35~55 55~60

25 → 55 55 → 65 65

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第2期

古锐等  HPLC 指纹图谱在中药及民族药品质评价中的应用

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413   结果分析

41311   由图 8 、图 9 可知 , 沙棘原料药材在图谱前

段大量色谱峰缺失 , 即黄酮苷被除去 。沙棘果中含

有水解酶 , 且活性较强 , 沙棘产地加工方法多为鲜 果压榨晒干或阴干 , 从采收到生产投料至少需要 3 个月 , 因此剩余的黄酮苷类被酶解生成苷元 , 在色 谱图上就反映出大量黄酮苷峰的消失 。

维空间来分析差异 , 主成分投影图如图 10 。 由主成分投影图可知沙棘生药材相似性较高 , 而沙棘原料药材在投影图中离散度较大 , 其中 B6 、 B16 峰面积较大 。由于黄酮类成分主要分布于沙棘 果皮部分 , 因此可以推断上述两批药材在加工过程 中除去了沙棘籽 。 5  讨论 511   上述研究证明 HPLC 指纹图谱作为一种定性与 定量技术 , 在药材品种品质评价方面具有反映特点 清晰 、适用性广等优势 。
512   应用指纹图谱能全面反映药材化学成分的特

图8  沙棘生药材 HPLC 指纹图谱

图9  提取醋柳黄酮用沙棘原料药材指纹图谱

图 10   沙棘药材样品主成分投影图

药材间整体差异 , 分析引起差异的主要化学组分 , 进而确定道地药材的化学特征 。 514   高效液相能与多种检测器联用 , 在本文实验 中 , 广泛应用了与二极管阵列联用的技术 , 结合文 献报道能快速判断化学成分的类型 , 如广枣指纹图 谱研究中黄酮类成分的确定 。如进一步采用蒸发光 散色检测器 , 以及质谱 、核磁共振波谱联用 , 将能 检测到更多的化学成分信息 。

41312   样品总黄酮部位指纹图谱主成分分析
参考文献 药大学硕士论文 , 20041 中草药研究 , 1991 , 31 - 32 (2 - 3) : 15 - 21 研究 [D ] . 成都中医药大学博士论文 , 20031 http://www.cnki.net

采用 “计算机辅助相似度评价系统”对 40 批 沙棘样品进行主成分分析 , 将 40 个样本投影到 2

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点 , 可以寻找特征性化学成分 , 通过定性分析或定 量分析 , 建立限度指标等方法 , 为品种鉴定 、药用 部位鉴定及产地加工分析提供参考 。 513   由于道地药材与非道地药材往往同种 , 其成 分差异不显著 , 因此应用指纹图谱 “模糊性 、整体 性”的特性 , 为药材道地性特征寻找提供了方法依 据 , 采用化学模式识别 , 应用化学计量学可以分析
[1 ] 邓科君 . 藏药广枣的民族药物学研究 [ D ] . 成都中医 [2 ] 肖小河 , 陈士林 . 论道地药材的系统研究 [J ] . 四川 [3 ] 张艺 . 藏药翼首草及其复方然降多吉胶囊的品质评价
( 收稿日期 : 2005211223)


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