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手性柱介绍

手性色谱柱知识介绍
手性色谱柱(Chiral HPLC Columns)是由具有光学活性的单体,固定在硅胶或其它聚 合物上制成手性固定相(Chiral Stationary Phases) 。通过引入手性环境使对映异构体间呈现 物理特征的差异,从而达到光学异构体拆分的目的。要实现手性识别,手性化合物分子与手 性固定相之间至少存在三种相互作用。 这种相互作用包括氢键、 偶级-偶级作用、 π-π作用、 静电作用、疏水作用或空间作用。手性分离效果是多种相互作用共同作用的结果。这些相互 作用通过影响包埋复合物的形成, 特殊位点与分析物的键合等而改变手性分离结果。 由于这 种作用力较微弱,因此需要仔细调节、优化流动相和温度以达到最佳分离效果。 在手性拆分中,温度的影响是很显著的。低温增加手性识别能力,但可能引起色谱峰变 宽而导致分离变差。因此确定手性分析方法过程中要考虑柱温的影响,确定最优柱温。 迄今为止,尚没有一种类似十八烷基键合硅胶(ODS)柱的普遍适用的手性柱。不同化学性 质的异构体不得不采用不同类型的手性柱, 而市售的手性色谱柱通常价格昂贵, 因此如何根 据化合物的分子结构选择适用的手性色谱柱是非常重要的。 根据手性固定相和溶剂的相互作用机制, Irving Wainer 首次提出了手性色谱柱的分类体 系: 第 1 类:通过氢键、π-π作用、偶级-偶级作用形成复合物。 第 2 类:既有类型 1 中的相互作用,又存在包埋复合物。此类手性色谱柱中典型的是 由纤维素及其衍 生物制成的手性色谱柱。 第 3 类:基于溶剂进入手性空穴形成包埋复合物。这类手性色谱柱中最典型的是由 Armstrong 教授开发的环糊精型手性柱[2],另外冠醚型手性柱和螺旋型聚合物,如聚(苯基 甲基甲基丙烯酸酯)形成的手性色谱柱也属于此类。 第 4 类:基于形成非对映体的金属络合物,是由 Davankov 开发的手性分离技术,也称 为手性配位交换色谱(CLEC) 。 第 5 类:蛋白质型手性色谱柱。手性分离是基于疏水相互作用和极性相互作用实现。 但由于市场上可选择的手性色谱柱越来越多,此分类系统有时很难将一些手性柱归纳 进去。因此参考 Irving Wainer 的分类方法,根据固定相的化学结构,将手性色谱柱分为以下 几种: 刷(Brush)型或称为 Prikle 型 纤维素(Cellulose)型 环糊精(Cyclodextrin)型 大环抗生素(Macrocyclic antibiotics)型 蛋白质(Protein)型 配位交换(|Ligand exchange)型 冠醚(Crown ethers)型 刷型:刷型手性色谱柱的出现和发展源于 Bill Prikle 及其同事的卓越工作。六十年代,Bill Prikle 将手性核磁共振中的成果运用到手性 HPLC 固定相研究中,通过不断实践,发明了应 用范围较广、柱效很好的手性色谱柱。 刷型手性色谱柱是根据三点识别模式设计的,属于 Irving Wainer 分类中的第一种类型。

刷型手性固定相分为π电子接受型和π电子提供型两类。 最常见的π电子接受型固定相 是由(R)-N-3,5-二硝基苯甲酰苯基甘氨酸键合到γ-氨丙基硅胶上的制成。此类刷型手性 色谱柱可以分离许多可提供π电子的芳香族化合物, 或用氯化萘酚等对化合物进行衍生化后 进行手性分离。 π电子供给型固定相常见的是共价结合到硅胶上的萘基氨基酸衍生物, 这种固定相要求 被分析物具有π电子接受基团,例如二硝基苯甲酰基。醇类、羧酸类、胺类等,可以用氯化 二硝基苯甲酰、异腈酸盐、或二硝基苯胺等进行衍生化后,用π电子供给型固定相达到手性 分离。 刷型固定相的优势在于其易于合成。合成方法在 Bill Prikle 的著作中有详细的说明。另 外,刷型固定相具有高的容量因子,因此具有高的选择因子。它的不利之处在于它仅对芳香 族化合物有效,有时不得不进行衍生化反应。但值得一提的是,这种衍生化反应是非手性衍 生反应, 所以不存在手性衍生的问题。 刷型手性色谱使用的流动相基本是极性弱的有机溶剂, 这对于制备色谱来讲未必是缺点。 近来,刷型固定相出现了π电子供给和接受基因的混合固定相。如:WHELK-O 和 BLAMO,及α-BURKE-Ⅱ固定相。α-BURKE-Ⅱ相十分适用于β-阻断剂的手性分离。典 型的流动相为二氯甲烷-乙醇-甲醇混合物,比例为 85:10:5。加入 10mM 醋酸铵可以调整 保留时间。SS BLAMO Ⅱ,同时具有π电子供体区和受体区,形成手性裂缝,因此对于某 些分子具有很高选择性。 纤维素型: 纤维素型手性色谱柱的分离作用包括相互吸引的作用及形成包埋复合物。它们属于 Wainer 分类中的第 2 种类型。市售的手性色谱柱为微晶三醋酸基、三安息香酸基、三苯基 氨基酸盐纤维素固定相。 很多化合物可通过此类型的色谱柱得到分离。 这种类型的手性色谱 柱种类也很齐全。流动相使用低极性溶剂,典型的流动相为乙醇-己烷混合物。但特别要注 意由于氯可以使纤维素从硅胶上脱落,因此要确保流动相中无含氯溶剂。 这种类型的手性色谱柱主要的制造商之一是日本的 Daicel 公司,他们生产的纤维素酯 和氨基甲酸纤维素柱可以分离多种生物碱和药物。特别值得一提的是 OD 柱。在某手性化合 物异构体的分离中,分离度超过了 25,这意味着载样量可以很高,对于制备十分有利。 纤维素固定相的每个单元都为螺旋型,而且这种螺旋结构还存在极性作用、π-π作用 及形成包埋复合物等手性分离因素。 淀粉代替纤维素制成的此类手性柱显示了和纤维素柱不 同的选择性,但是稳定性较差。因为淀粉是水溶性的,因此流动相中必须绝对无水才能保证 柱子寿命。目前此类型的柱子能分离 80%左右可能面临到的所有手性化合物。此类柱子通 常用于正相系统,用正己烷-乙醇,正己烷-异丙醇混合溶剂为流动相。OD 柱也可用于反相 的情况,但流动相必须含有高浓度的高氯酸盐缓冲液,以防止固定相溶解。即使这样,使用 较长时间以后色谱柱也难免要受到损害, 但是在某些情况下使用反相系统分离效果要优于使 用正相系统。 环糊精型:

环糊精是通过 Bacillus Macerans 淀粉酶或环糊精糖基转移酶水解淀粉得到的环型低聚 糖。 通过控制环糊精转移酶的水解反应条件可得到不同尺寸的环糊精。 市售的环糊精主要是 α、β、γ三种类型,分别含 6、7、8 个吡喃葡萄糖单元。环糊精分子成锥筒型,构成一个 洞穴, 洞穴的孔径由构成环糊精的吡喃葡萄糖的数目决定。 环糊精类型及洞穴的孔径等见下 表: 环糊精 α β γ 糖元数目 6 7 8 洞穴孔径 4.5-6.0 6.0-8.0 8.0-10.0 可进入洞穴的分子类型 5-6 元环的芳香族化合物 联苯或萘 取代芘和类固醇 手性中心数目 30 35 40

2,3 位仲羟基分布在环糊精洞口,6 位伯羟基在环糊精分子的外部,这意味着洞穴内部 是相对疏水的区域。 用环糊精手性固定相产生手性识别要求被拆分物的疏水部分能嵌入环糊 精洞穴中,形成可逆的、稳定性不同的包合物,环糊精洞口的羟基和被拆分物的极性基团相 互作用。 由于形成包合物速度较慢, 因此可能导致色谱峰峰形较差, 同样也影响了其在制备色谱 中的应用。环糊精固定相的选择性取决分析物的分子大小;α-环糊精只能允许单苯基或萘 基进入,β-环糊精允许萘基及多取代的苯基进入,γ-环糊精仅用于大分子萜类。β-环糊精 手性固定相应用范围最广。Ibuprofen 通过β-环糊精色谱柱得到分离,说明了 pH 值对氢键 的影响。当流动相的 pH=7 时,观察不到拆分的迹象。pH=4 时,可达到好的分离效果。通 常分离氨基酸时, 常采用低的 pH 值, 以抑制酸性基团的离子化, 同时也增强氨基的质子化。 磷酸三乙胺盐、乙酸三乙胺盐证明对β-环糊精色谱柱来说是很好的缓冲液。通常缓冲液是 0.1%三乙胺溶液,用磷酸或醋酸调节到合适的 pH 值。高的流速会降低形成复合物的能力, 低流速分离效果较好,0.5-1ml/min 的流速最好。另外,增加缓冲液的浓度可以克服流速的 影响,因为它可以增加环糊精洞穴和流动相的吸引力。 常用缓冲液及其使用浓度如下表所示: 缓冲液 TEAA(乙酸三乙胺盐) NH4NO3 柠檬酸盐 醋酸铵 浓度 0.01-2% (用于减小包埋) 10-500mM (特别适合于酸性化 10-200mM 10-200mM 合物) 目的

pH 值选择如下: 醇和胺 酸 pH4 pH7 (加强 NH 的离子化)

优化手性分离条件要考虑的方面有:pH 值对分离度的影响;流速对分离度的影响;柱 温、有机相比例、缓冲盐浓度对分离度的影响。

环糊精的修饰:最近,对环糊精的修饰使环糊精型手性色谱柱可以分离更多的化合物, 并可用于气相手性色谱分离。衍生化是通过将不同的基因键合到环糊精洞穴表面的羟基上。 衍生化反应包括乙基化、S-羟基丙基化、生成 S 或 R-萘基乙基氨基甲酸盐、3,5 二甲基苯 基氨基甲酸盐和环状对甲苯酰酯。 这些新型的环糊精固定相有许多优点, 它们可以分离更多 化合物,价格上也有竞争力,由于改进了手性识别能力使其更适用于制备色谱。 配位交换型: 手性配位交换色谱 (Chiral Ligand Exchange Chromatography, CLEC) Davankov 发明, 由 是通过形成光学活性的金属络合物而达到手性分离, 属于 Irving Wainer 分类中的第 4 类手性 固定相,主要用于分离氨基酸类。 由于此类固定相是由手性氨基酸—铜离子络合物键合到硅胶或聚合物上形成, 因此流动 相中必须含有铜离子以保证手性固定相上的铜离子不至流失。 其它的过渡金属元素也已用于 手性配位交换色谱, 但铜离子应用最广。 形成络合物的过程十分缓慢, 因此有时需提高柱温, 最佳温度约 50℃。 手性配位交换色谱仅对α- 氨基酸和其类似物有效。β-氨基酸很难用手性配位交换色 谱得以分离。手性配位交换色谱可用于制备,由于流动相中存在铜离子,虽然铜离子能用离 子交换柱除去,但增加了样品处理的困难。 大环抗生素型: 大环抗生素型手性色谱柱是最近发展起来的,通过将大环抗生素键合到硅胶上制成的 新型手性色谱柱。大环抗生素型手性色谱柱的出现归功于 Dan Armstrong 的贡献。此类色谱 柱常用的大环抗生素主要由三种:利福霉素(Rifamycin) ,万古霉素(Vancomycin) ,替考 拉宁(Ticoplanin) 。利福霉素作为手性添加剂在毛细管电泳分离手性化合物方面得到了成功 运用。万古霉素和替考拉宁分子结构中存在“杯”状结构区和糖“平面”结构区。此类色谱 柱性质稳定,可用于多种分离模式。手性分离基于氢键、π-π作用、形成包合物、离子作 用和肽键等。 替考拉宁分子量为 1885,结构中存在 20 个手性中心,3 个糖基和 4 个环。酸性基团在 多肽“杯”/ “裂层”的一端,碱性基团在它的另一端。酸性基团和碱性基团提供了离子作 用点。糖基在三个平面上,可折叠起来将化合物分子包埋在多肽“杯”中。 万古霉素分子量为 1449,结构中存在 18 个手性中心,3 个环。万古霉素具有“篮状” 结构,它的附近还有一个可弯曲的糖平面,可将分析物分子包埋在“篮子”中。羧基和仲氨 基分布在“篮子”的边缘,参与和分析物分子产生离子作用。万古霉素手性色谱柱可用于反 相模式、正相模式和极性模式。万古霉素手性色谱柱可以分离胺类、中性酰胺、脂类。但对 于酸性化合物选择性较低。在反相模式中,有机相常用四氢呋喃、乙腈和甲醇。水相常用三 乙胺-乙酸缓冲液。色谱柱适用的 pH 范围为 4-7。通常优化碱性化合物手性分离条件时,选 择 pH=7 为起点比较好。另外四氢呋喃、乙腈有最好的选择性。有时采用纯的甲醇和乙醇作 流动相也可达到好的分离效果。万古霉素手性色谱柱也可用正相模式,采用正己烷/乙醇为 流动相。 万古霉素手性色谱柱载样量可以很大,非常适用于制备色谱。

蛋白质型: 蛋白质型手性色谱柱属于第 5 种类型。 分离依赖于疏水相互作用和极性相互作用。 已经 有 多 种 蛋 白 质 用 于 此 类 手 性 色 谱 柱 。 目 前 使 用 较 多 的 是 α - 酸 性 糖 蛋 白 ( α -Acid Glycoprotein,AGP) ,人血清白蛋白(Human Serum Albumin,HSA) ,牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)和卵类粘蛋白(Ovomucoid,OV) 。 α-酸性糖蛋白分子由 181 个氨基酸残基和 40 个唾液酸(sialic acid)残基构成。α-酸 性糖蛋白分子偏酸性,等电点为 2.7。含有两个二硫键,性质很稳定。α-酸性糖蛋白分子可 以共价键合到硅胶上,制成手性色谱柱,可以分离许多化合物。α-酸性糖蛋白手性色谱柱 使用的流动相通常为 pH 4-7 的磷酸盐缓冲液和很小比例的有机相。有机相首选异丙醇,如 达不到分离要求,可以尝试乙腈,乙醇,甲醇或四氢呋喃。有机相的改变导致蛋白结构发生 暂时的改变。色谱柱的负载量至关重要,典型的负载量为 0.02mg/ml 的浓度样品,进样 20 μl。pH 的改变对手性选择性起关键作用,尤其是胺类化合物。pH 降低导致蛋白质负电荷 的降低, 引起胺类化合物保留时间减小, 然而这意味着可以减小有机相比例, 使选择性增加, 峰形改善。 通过调节有机相比例仍无法达到分离效果时, 有时需用电荷调节剂。 但这可能引起蛋白 结构的永久改变,这些电荷调节剂包括丁酸、辛酸、癸酸和二甲基辛胺。有时也用到 1,2 亚乙基二醇,1,2 丁醇和氯化钠。温度对分离也有影响,温度增加保留时间,减小分离因 子。人血清白蛋白(HSA)分子量为 69,000,等电点为 4.8。蛋白中认为存在两个药物结合 位 点 : 华 法 令 - 氮 杂 普 鲁 帕 宗 ( warfarin-azapropazone ) 和 苯 基 二 氮 杂 - 吲 哚 (benzodiazapine-indole)结合位点。流动相中加入辛酸,采用人血清白蛋白手性色谱柱可以 有效分离 benzodiazapine。Warfarin 和 oxazepam 也用人血清白蛋白手性色谱柱得到了分离, 流动相组成为:100mM 磷酸缓冲液 pH7:乙腈:异丙醇 = 84:10:6。 牛血清白蛋白(BSA)为球型蛋白,分子量为 66,000,等电点为 4.7。此蛋白为一个单 氨基酸链,通过 17 个二硫键形成 9 个双环。许多化合物通过牛血清白蛋白手性色谱柱得到 分离。牛血清白蛋白不如α-酸性糖蛋白稳定,一些有机溶剂(如乙腈、甲醇)可使蛋白变 性,因此使用起来要特别注意。 卵类粘蛋白由蛋清中提取,分子量为 55,000。它可分离大量的胺类和酸类化合物。 蛋白手性色谱柱的载样量均较小。影响了蛋白手性色谱柱在制备色谱中的应用。 蛋白手性色谱柱在所有手性色谱柱中是应用最广的色谱柱,但并不是效果最好的色谱 柱。 冠醚型: 冠醚类固定相用于分离一级胺, 一级胺必须质子化方能达到分离。 因此必须使用酸性流 动相,如高氯酸。最常用的是冠醚类固定相是 18-冠-6,已有商品化产品,由 Daicel 公司制 造。无论(+)或(-)型均可达到有效分离,并可通过变化(+) (-)类型而改变分析物出 峰顺序。冠醚作为添加剂也用于核磁共振和电泳,但由于其毒性较大,有致癌性,使其应用 受到限制。


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