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医学微生物学实验二 基础医学院病原生物学教研室 主要内容 ? 革兰染色(Grams stain) ? 培养基及接种 革兰染色(Grams stain) Gram stain-------由丹麦细菌学家革兰(Hans Christian Gram)创建的一种鉴别染色法。 ? 原理 ? 程序 ? 结果 ? 意义 革兰染色原理 ? 细胞壁结构不同 ? 等电点差别 革兰染色程序 ? 程序: 涂片 干燥 固定 染色 镜检 染色过程及结果 革兰染色 采用4种试剂分4步: 结晶紫 1min 水洗 碘液 1 min 水洗 95%乙醇 30 s 水洗 复红 1 min 水洗 (初染) (媒染) (脱色) (复染) 革兰阳性菌 (菌体为紫色 ) 革兰阴性菌 (菌体为红色) 革兰染色意义 ? 鉴别细菌 ? 帮助临床选择用药 ? 理解细菌的致病作用 培养基及接种 ? 培养基制备(示教) ? 培养基接种 ? 细菌的培养方法 基础培养基制备(示教) 1.培养基的概念: 将适合于细菌生长繁殖的各种营 养物质用人工的方法配制而成的营养 基质。 2.培养基的制备过程 ? 以牛肉膏汤培养基为例(液体) 调pH 成分: 过滤 分装 牛肉膏3克 蛋白胨10克 加热融化 调配 高压灭菌 氯化钠5克 蒸馏水1000毫升 无菌检测 冰箱备用 肉汤培养基 ? 取1000毫升肉浸液,加入10克蛋白胨 和5克氯化钠 经上述步骤制成。 ? 其营养价值较牛肉膏汤要高。 ? 但因肉浸液制作烦琐,而牛肉膏汤培 养基制作简单,故常用。 固体、半固体琼脂培养基 ? 琼脂:属于凝固剂,其化学成份主要是酸 性多糖。其特点是当温度达到98℃以上可 融化于水,45℃以下则凝固。 ? 半固体琼脂培养基:取100毫升pH7.8的肉 汤或牛肉膏汤培养基加入0.3~0.5%琼脂 制成。 ? 固体琼脂培养基:取100毫升pH7.8的肉汤 或牛肉膏汤培养基加入2~3克的琼脂制成。 培养基的种类 ? 按照培养基的用途可分为五类。 ? 按照培养基的物理性状可分为液体, 固体和半固体三类。 厌氧培养基 选择培养基 营养培养基 鉴别培养基 基础培养基 培养基按照物理性状 分类 固体平板培养基 液体培养基 固体斜面培养基 半固体培养基 培养基接种 ? 固体平板培养基 ? 固体斜面培养基 ? 液体培养基 ? 半固体培养基 固体平板培养基 ? 用途:分离混杂的细菌 ? 接种方法:连续平行划线法和分区划 线法 ? 生长现象:呈菌苔和菌落样生长 1.连续平行划线法 ? 涂基线 ? 划线 ? 划线完毕,将琼脂平板培养基复盖皿盖, 并在培养皿底玻璃上,用蜡笔注明接种菌 名、接种者姓名及班级、日期等,将培养 皿倒置放在37℃孵育箱培养,以避免培养 过程中凝结水自皿盖滴下,同时可以保持 琼脂表面的湿润。 平行划线法的示意图 ? A B是最常使用的、最基本的方法,其中 图B常用于含菌量较少的标本。 2.分区划线法 ? 基本步骤与平行划线法相同,不同之处是 在每次划线前要烧灼接种环,以杀灭环上 留剩的菌液。 ? 用于含菌量较多的混杂标本。 ? 本次试验要求同学掌握细菌分离培养的分 区划线法。 固体平板培养基 ? 用途 ? 接种方法 ? 生长现象 细菌在固体平板培养基上的 生长现象 ? 细菌在固体平板培养基上呈菌苔或菌 落样生长。 ? 观察琼脂平板表面生长的各种菌落, 注意其大小、形状、边缘、表面结构、 透明度、颜色、溶血环等性状。 细菌在固体平板培养基上呈菌苔和菌落样生长 细菌在固体培养基中的生长情况 光滑型菌落 S型 粗糙型菌落 R型 粘液型菌落 M型 固体斜面培养基 ? 用途:观察细菌的培养特性、生化反应、 保存菌种。 ? 接种方法:连续划线法。 ? 生长现象:呈菌苔样生长。 操作手法 斜面接种法 固体斜面培养基接种后细菌生长 现象 液体培养基 ? 用途:增菌及检测生化反应。 ? 接种方法:研磨接种。 ? 生长现象:浑浊、沉淀、菌膜样生长。 液体培养基接种法 细菌在液体培养基中的生长现象 菌膜 对照 菌沉淀 均匀浑浊 半固体培养基 ? 用途:检测细菌动力、生化反应。 ? 接种方法:接种针穿刺法 ? 生长现象: 沿穿刺线生长----无动力。 沿穿刺线扩散生长(呈云雾状或羽毛状) ---有动力。 穿刺培养的生长特征 细菌在半固体培养基中的生长现象 A、有动力 B、无动力、 C、空白对照 细菌的培养方法 ? 普通培养法 ? 二氧化碳培养法 ? 厌氧培养法 普通培养箱 厌氧罐 厌氧袋 厌氧培养箱 Thank You! 细菌的细胞壁 ( cell wall ) 1. 化学组分: 革兰 肽聚糖 peptidoglycan 阳性 菌 磷壁酸 techoic acid 聚糖骨架 四肽侧链 五肽交联桥 革兰 阴性 菌 肽聚糖 peptidoglycan 脂多糖 lipopolysaccharide,LPS 脂质双层:内有OMP 脂蛋白 外膜 G+菌肽聚糖结构 G-菌肽聚糖结构 革兰阳性菌细胞壁结构 外 膜 革兰阴性菌细胞壁结构