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条斑紫菜HSP90基因实时荧光定量PCR检测方法的构建_图文

第 19 卷 第 2 期 2010 年 6 月

淮海工学院学报 ( 自然科学版 ) Jo ur na l of H uaihai Institute of T echnolo gy ( N at ural Sci ence Edit ion )

V ol. 19 N o. 2 Jun. 2010

DOI: 10. 3969/ j. issn. 1672 6685. 2010. 02. 021

条斑紫菜 HSP90 基因实时荧光定量 PCR 检测方法的构建
周向红a , 阎斌伦a, b , 王 萍a , 易乐飞a, b
222005)

*

( 淮海工学院 a. 海洋学院 ; b. 江苏省海洋生物技术重点建设实验室 , 江苏 连云港

摘 要 : 以管家基因 18S rRNA 为内参 , 采用 SYBR Green I 荧光染料法, 构建了条斑紫菜 H SP90 基因实时荧光定量 PCR 的检测方法, 为条斑紫菜 H SP90 和 18S rRNA 基因筛选出定量引物各 1 对, 获得的扩增曲线基线平整 、 指数区明显、 斜率大且固定。 两基因的熔解曲线显示单特异峰, T m 分别为 88 5 和 85 。 两基 因 标准 曲线 的斜 率分 别为 - 3 307 和 - 3 308, 扩增 效率 都 约为 100 6% , Ct 值在 13~ 32 范围内有良好的线性关系。 构建的实时荧光定量 P CR 检测方法灵敏度 高、 特异性强, 准确可靠、 重复性好, 检测周期短, 为进一步研究 H SP90 基因在胁迫下的表达差异奠 定了基础。 关键词 : 条斑紫菜; H SP 90 基因 ; 18S rRNA 基因 ; 实时荧光定量 PCR; SYBR Green I 中图分类号 : Q75 文献标识码 : A 文章编号: 1672 6685( 2010) 02 0081 04

Establishment of Real time PCR for HSP90 Gene of Porp hy ra y ez oensis Udea
ZH OU Xiang hong , YAN Bin lun , WANG P ing , YI L e f ei
L ianyung ang 222005, China)
a a, b a a, b

( a. Schoo l of M arine Science; b. Jiang su K ey L ab of M ar ine Bio technolog y, Huaihai Institute of T echnolog y,

Abstract: T he m et hod of r eal tim e PCR fo r H SP90 gene of P or p hy r a y ez oensis U dea w as est ab lished w it h 18S rRNA as the reference gene, using SYBR Green I. T he optimal primers fo r H SP 90 and 18S rRNA gene w ere select ed and amplif icat ion curve had f lat baseline, dist inct ex po nent ial area, larg e and stable slo pe. T he melt ing curve o f the t w o g enes show ed a sing le peak wit h a T m o f 88. 5 and 85 respect ively. St andard curve s slope o f t he tw o genes w as - 3. 307 and - 3. 308 respect ively. Am plif icat io n ef ficiency of t he t w o g enes w as 100. 6% . T he linear range o f st andard curve f or relat ive quantif icat ion w as 13 ! 32. T he real t ime P CR method developed in t his st udy is hig hly sensit ive, specif ic, accur at e, reproducible and quick, w hich pro v ides t he basis fo r f ur ther invest igat ion of H SP90 ex pr ession under st ress. Key words: Por p hyr a y ezoensi s Udea; H SP90 gene; 18S rRNA gene; real t ime PCR; SYBR Green I

对热激蛋白 ( heat shock pro tein, H SP ) 的分子 生物学研究最早见于 1962 年 , 通过观测果蝇 ( Dro sop hi la hy d ei ) 幼 虫 唾 腺 染 色 体 上 的 涨 泡 变 化 ,

RIT OSSA F 发现热处理后基因表达发生了显著 改变。进一步研究表明 , H SP 在整个生物界普遍存 在且高度保守 [ 2] 。根据分子质量大小 , H SP 可分为

[ 1]

*

收稿日期 : 2010 05 05; 修订日期 : 2010 05 31 基金项目 : 江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题 ( 2008H S004) ; 淮海工学院自然科学基金资助项目 ( Z2007035) 作者简介 : 周向红 ( 1977- ) , 女 , 广西钦州 人, 淮海 工学院 海洋学 院实验 师 , 主 要从事 生物化 学与分 子生物 学的教 学与研 究 , ( E mail ) zx h309309@ yah oo. com . cn。

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5 个主要家族, 分别是小分子 H SP, HSP60, H SP70, HSP90 和 H SP100 。作为细胞内质量控制体系的 重要组分, H SP 负责新合成蛋白的折叠、 组装、 转运 以及折叠错误和 不稳定蛋白的降解[ 3] 。 H SP 90 是 主要的分子伴侣之一 , 在细胞内含量丰富 , 其主要功 能是调控 蛋白折叠。但与其 他 H SP 不 同, H SP 90 的大多数底物是信号传递蛋白 , 故在信号传递网络、 细胞周期调控、 凋亡、 蛋白降解和运输等方面都具有 重要作用
[ 3] [ 3]

F ree DNase I( F erment as) , Prim eScr ipt RT reag ent Kit ( T aKaRa) 和 SYBR Premix Ex T aq ? Kit ( T aKaRa) , 主要仪器 有核酸蛋白定 量仪 ( BioRad)
IM

和实时荧光定量 P CR 仪 ( Bio Rad) 。 1 2 总 RNA 分离纯化 首先, 用 T RIzo l 法抽提条斑紫菜总 RNA, 取条 斑紫菜叶状体 , 液氮研磨, 加 T RIzo l 和氯仿混匀 , 离 心后取上清液, 加异丙醇沉淀 RN A, 以体积分数为 75% 的乙醇洗涤, 无 RNase 水溶解 ; 其次, 用 DNase I 除去总 RNA 中残留的 DNA, 按 1 g 总 RNA 加 入 2 U RNase inhibito r 和 1 U DN ase I ( RNase f ree) 的比 例配 制反 应液 , 反 应液 在 37 水 浴 30 m in 后 , 常规 酚/ 氯 仿抽提 ; 最后 , 用适 量无 RNase 水溶解总 RNA 。电泳检测总 RNA 的完整性 , 核酸 蛋白定量仪检测总 RNA 的纯度。 1 3 反转录 反转录反应在 10 L 体系中进行, 反应液中含 有 2 L 5 # PrimeScriptT M Buffer, 0 5 L Prime ScriptT M , RT Enzyme Mix I, 25 pmol Olig o dT Primer, 50 pmol Random 6 mers, 400 ng 总 RNA 。反应条件 为 37 下反应 15 min, 85 保温 5 s, 终止反应。 1 4 引物设计 根据笔者已经克隆并提交至 GenBank 的条斑 紫 菜 H SP90 基 因 的 cDNA 序 列 ( 索 引 号: GU301885) 和 GenBank 上已有的条斑紫菜管家基 因 18S rRNA 基因序列( 索引号 : DQ666486) 分别设 计 3 对和 2 对引 物 ( 见表 1) , 引物由生 物工程 ( 上 海 ) 有限公司合成。

。此外, H SP90 在植物免 疫、 抗病性 及
[ 4 5]

对胁迫环境的应答中也起着重要作用 。 条斑紫菜 ( Por p hy ra y ez oensi s U dea) 是红 藻 门、 原红藻纲、 红毛菜科的大型海藻 , 在我国北方沿 海大面积栽培 , 具有重要的经济价值 。条斑紫菜 叶状体生活在潮间带 , 落潮后藻体暴露在空气中, 面 临强光照、 失水和高温等各种非生物胁迫。因此, 深 入研究条斑紫菜 H SP 90 在逆境下的表达, 对正确认 识胁迫信号的传导、 抗逆相关基因的调控以及提高 条斑紫菜抗逆性有重要的理论意义和应用价值。 本研究以管 家基因 18S rRNA 为内参, SYBR Green I 作荧光染料, 构建了条斑紫菜 H SP90 基因 实时荧光定量 P CR ( real t ime f luorescence quanti t at ive PCR) 的检测方法 , 为进一步研究 H SP 90 基 因在胁迫下的表达差异奠定了基础。
[ 6]

1 材料与方法
1 1 主要试剂与仪器 主要试剂有 T RIzol 试剂 ( Invit rog en) , RNase

表 1 实时荧光定量 PCR 反 应引物 Table 1 Primer sequences f or quantitative real time PCR
基因 H SP90Q 1 HS P90 基因 H SP90Q 2 H SP90Q 3 18S rR N A Q 1 18S rRN A 基因 18S rR N A Q 2 引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 正向引物 反向引物 序列 5 ? G GC TG G CGG CT CTT T CA C 3? 5 ? CG G TCT TG T CCTC A TCCT CA T C 3? 5 ? A G A A GG T G GA G A A G G TG G TT G TG 3? 5 ? A CCG TC TT G TCCG TC TT G TCA G 3 ? 5 ? G A GG A G TC GG A G G AG G A G A A G 3 ? 5 ? CCA G GC GG T CA GA C AC A A C 3? 5 ? G TG CT GG CG A CT CCTCA T T C 3? 5 ? G CCTG CT GC CTT CCT TG G 3? 5 ? T GCCA G CA CT G CGT T CTT A CC 3 ? 5 ? A G CCTT CCG A CCCA G G AC TA T C 3? 扩增片段大小 227 bp 235 bp 124 bp 153 bp 163 bp

1 5

实时荧光定量 P CR 的条件优化 在 Bio Rad 的 IQ5 PCR 仪上使用 SYBR Green

应体系中包含 12 5 L SYBR Premix Ex T aq T M ? (2 #)、 适量引物和 2 L 反转录产物。反应条件为 95 预变性 1 m in, 然后 进入循环 , 共 40 个循环。

I 染料法进行实时荧光定量 PCR 反应。 25 L 的反

第2期

周向红等 : 条斑紫菜 HSP90 基因实时荧光定量 P CR 检测方法的构建

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每一次反应都设置阳性对照、 阴性对照组和非模板 对照 , 每个反应设 3 个复孔。反应结束后 , 从 55 缓慢升温到 95 , 制备熔解曲线。 按照试剂盒推荐的体系 , 在其他条件不变的情 况下 , 依次改变 P CR 循环条件 ( 三步法和两步法 ) 、 引物 ( H SP 90 的 3 对引物 和 18S rRNA 的 2 对 引 物) 、 引物浓度( 0 1~ 0 5 mol/ L ) 、 退火温度 ( 58~ 63 ) , 通过考察产物特异性、 熔解曲线、 标准曲线 等参数来选择最优条件。将反转录产物进行 10 倍 系列稀释后作模板, 在最优条件下制作标准曲线。

H SP90 和 18S rRNA 基因的扩增曲线、 熔解曲线和 标准曲线进行了分析。每对引物在各自基因上都得 到了% S& 形扩增曲线 ( 见图 3a) , 扩增曲线基线平整、 指数区明显、 斜率大且固定 , 非模板对 照呈水平直 线 , 3 个复孔的扩增曲线基本重叠, 说明扩增曲线良 好。熔解曲线显示 H SP 90 和 18S r RNA 基因扩增 产物均为单一的特异峰 ( 见图 3b) , T m 分别为 88 5 和 85 , 表明无引物二聚体及非特异性产物 , 扩增 产物特异性高。对 10 倍稀释的系列模板进行定量 P CR 反应 , 得出了 H SP90 和 18S rRN A 基因的相 对定量标准曲线( 见图 3c) ; 标准曲线回归方程分别 为 y = - 3 307x + 16 804 和 y = - 3 308 x + 6 160, 其中 y 为 Ct 值 , x 为稀释倍数以 10 为底的对数 ; 相 关系数分别为 0 995 和 0 997, 说明直线线性好 , 定 量准确 ; 扩增效率都为 100 6% , Ct 值在 13~ 32 范 围内有良好的线性关系。

2 结果
2 1 总 RNA 质量 抽取的总 RNA 电泳后显示出整齐的 rRNA 条 带( 见图 1) , 核酸蛋白定量仪检测结果显示总 RNA 的 A 260 / A 280 = 1 9 ~ 2 1, A 260 / A 230 = 2 1~ 2 3, 说 明总 RNA 片段完整, 纯度高 , 适合后续试验。 2 2 实时荧光定量 PCR 的条件优化 用两步法和三步法均获得了基本一致的结果 , 由于两步法较三步法简便, 故后续试验均采用两步 法。由于 H SP90 基因的 H SP90Q 1 引物出现了非 特异性扩 增 ( 见图 2a, 箭 头指 示非 特异 性 扩增 ) , 18S r RNA 基因的 18S rRNAQ 1 引物 在非模板 对 照中也出现了非特异性扩增 ( 见图 2b) , 所以舍弃这 两对引物。 H SP 90 基 因的 H SP 90Q 2 引物 的标准 曲线稍 差于 H SP90Q 3 引 物。 因此 后续 试 验中 , H SP 90 和 18S rRNA 基因分别采用 H SP90Q 3 和 18S r RNAQ 2 引物。引物 浓度 最终为 0 2 m ol/ L, 退火温度为 61 5 2 3 。 扩增曲线 、 熔解曲线和标准曲线 确立实时荧光定量 PCR 的最优条件后, 对

Fig. 1

图 1 条斑紫菜总 RNA 电泳 Ge1 electrophoresis of total RNA extracted from Porp hy ra y ezoensis

图2

引物筛选

Fig. 2 Primer screening

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( P < 0 05) , 进而提出实验中应尽量使目的基因和 内参基因引物间扩增效率一致 , 且尽可能接近于 1, 特别是当样本间差异表达倍数较小时 , 对引物的选 择更 应 慎 重。本 研 究 针 对 条 斑 紫 菜 H SP 90 和 18S rRNA 基因分别设计了 3 对和 2 对引物, 从中筛 选出各 1 对引物, 其扩增效率都约为 100 6% , 且接 近于 1, 故本研究筛选出的 2 对引物设计合理 , 适合 条斑紫菜 H SP90 基因的相对定量分析。 条斑紫菜 H SP 90 和 18S rRNA 基因扩增曲线 呈% S& 形, 基线平整、 指数区明显、 斜率大且固定 , 非 模板对照呈水平直线, 3 个复孔的扩增曲线基本重 叠 ; 熔解曲线上仅有单一的特异峰, 标准曲线的斜率 分别是 - 3 307 和 - 3 308, 相 关系数 为 0 995 和 0 997, 扩增 效率 都约 为 100 6% , 线 性关 系良 好。 因此本研究构建的实时荧光定量 P CR 检测方法灵 敏度高、 特异性强 , 准确可靠、 重复性好, 为进一步研 究 H SP90 基因在胁迫下的表达差异奠定了基础。 参考文献:
[ 1] RI T OSSA F. A new puffing pattern induced by tem perature shock and DN P in droso phila[ J] . Cellular and M o lecular Life Sciences, 1962, 18( 12) : 571 573. [ 2] [ 3] 图 3 HSP90 和 18S rRNA 基因的扩增结果 Fig. 3 Amplif ication result of HSP90 and 18S rRNA gene [ 4] LI NDQ U IST S. T he heat shock response [ J] . A nnual Rev iew Bio chemistr y, 1986, 55: 1151 1191. W A N G Wang xia, V IN OCU R B, SH OSEYO V O, et al. Ro le o f plant heat sho ck pr oteins and mo lecular chap ero nes in the abio tic str ess response [ J] . T rends Plant Science, 2004, 9( 5) : 244 252. 孙秀玲 , 孙同虎 , 薄鹏飞, 等. 热激蛋白 90 在植物发育和 疾病抗性中的作用 [ J] . 生命化学, 2008, 20( 1) : 142 146. [ 5] 宋红苗 , 陈显扬 , 李银 心 . 植物热激蛋白 90 的结构和 功 能 [ J] . 植物生理学通 讯 , 2007, 43( 6) : 1002 1008. [ 6] 杨晓玲 , 郭金耀 . 连云 港条斑紫菜叶状体的细胞发育 特 性 研究 [ J] . 淮 海 工 学 院学 报 : 自 然科 学 版 , 2009, 18 ( 2) : 90 92. [ 7] BU ST IN S A , BEN ES V, N O LA N T , et al. Quantita tiv e r ea l time RT PCR a per spectiv e [ J] . Jo ur nal o f M o lecular Endocrino lo gy , 2005, 34( 3) : 597 601. [ 8] BU ST IN S A . Q uantificatio n o f mRN A using real t ime r everse tr anscr ipt ion P CR ( R T PCR ) : t rends and pro blems [ J ] . Jo ur nal of M o lecular Endo cr inolog y, 2002, 29( 1) : 23 39. [ 9] 刘 正霞 , 徐阳 , 徐进梅 , 等 . 不同引物及数据分析方法 对 定量 PCR 结果的影响 [ J] . 南京医 科大学学报 : 自然 科 学版 , 2009, 29( 8) : 1112 1117.

3 讨论
近年来 , 实时荧光定量 PCR 被广泛应用于生物 学、 医学和诊断学研究, 该技术利用荧光分子实时监 测 PCR 反 应 过 程 中 扩 增 产 物 的 含 量 [ 7] 。 SYBR Green I 能非特异性地掺入到双链 DNA, 激发后发 出荧光, 故可检测任意基因的扩增产物变化, 但它不 能区分非特异扩增[ 8] 。本文筛选了多对引物并优化 了反应条件 , 以消除非特异性扩增的影响。又由于 不同组织的起始细胞数目、 RNA 提取和扩增效率都 不相同 , 本文选择了表达相对稳定的 18S rRNA 基因作对照 , 以矫正 H SP 90 基因的表达量。 同一目的基因的不同引物对定量存在影响。文 献[ 9] 的研究显示, 在相同条件下 2 个目的基因分别 通过 4 对引物扩增得到的结果经分析均有显著差异
[ 8]

( 责任编辑: 秦海明 , 鲁雪峰)


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