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干扰素的功能、制备方法和工艺的研究


干扰素的制备工艺的研究
姓名:刘海燕 班级:11 生工 1 学号:20110801105

摘要:干扰素(IFN)是一种广谱抗病毒剂,并不直接杀伤或抑制病毒,而主要 是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白,从而抑制乙肝病毒的复制,其 类型分为三类,α -(白细胞)型、 β -(成纤维细胞)型,γ -(淋巴细胞)型; 同时还可增强自然杀伤细胞(NK 细胞) 、巨噬细胞和 T 淋巴细胞的活力,从而起 到免疫调节作用, 并增强抗病毒能力。干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质 (主要是糖蛋白) ,是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种 细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长,以及分化、调节免疫功能等多种生物 活性。 本文在查询大量文献,由作者归纳整理得出了关于干扰素的功能、制备 方法和工艺的一些新的理论和实际应用。 更好的了解了干扰素的作用机制以及对 人类社会的重要用途。 关键词:干扰素,功能,生产过程,制备工艺 1 干扰素简介 干扰素是一种细胞因子。 它是机体感染病毒时,宿主细胞通过抗病毒应答反 应而产生的一组结构相似、功能相近的低分子糖蛋白。干扰素干扰病毒复制,它 是机体抗病毒感染的防御系统干扰素的种类很多,有人体干扰素、动物干扰素、 昆虫干扰素、 植物干扰素和细胞干扰素。目前所知道的人体干扰素按细胞结构和 来源分 α、β、γ 干扰素三个型别,α 干扰素又称人白细胞干扰素,它是由 B 淋巴 细胞和单核细胞产生的,它可以分为 23 种亚型,分别称为干扰素 α1、α2a、α2b、 α3 等,它们相互之间有较高的同源性。人 β-干扰素又称人纤维母细胞产生的, 有一个亚型。γ 一干扰素又称免疫干扰素,它是由淋巴细胞的辅助诱导细胞产生 的,与 α、β 干扰素之间没有明显的同源性。三种干扰素都有抗病毒、抗肿瘤及 免疫调节活性。 基因工程干扰素是指从人细胞中克隆出干扰素基因,将此基因与 大肠杆菌表达载体连接物构成重组表达质粒,然后转化到大肠杆菌中,从而获得 高效表达人干扰素蛋白的工程菌, 工程菌经发酵后可收集到大量菌体,将菌体破
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裂,用先进的生物工程手段将干扰素蛋白从菌体分离、纯化,得到高纯度的人基 因工程干扰素。 基因工程干扰素的出现,是干扰素研究工作的一项重大突破它使 得干扰素能进人大规模产业化生产,人们能获得大量活性高、疗效好的干扰素。 2 干扰素的研究意义 近年来,在国家反病毒和抗癌研究领域,自然免疫调节和抗病毒物质,作为 一种天然抗病毒蛋白质干扰素引发人们的关注。干扰素将成为一个 21 世纪的反 病毒,防癌,其中最广泛使用的药物之一。 α-干扰素治疗慢性乙型肝炎是目前 抗病毒药物的第一选择是,对肝炎的药物治疗总有效率约为 20%-30%。慢性肝 炎的药物干扰素代表发展方向。它是唯一的 C 型肝炎病毒的药物有效的治疗, 它是最广泛的肿瘤细胞因子的临床治疗。病毒性皮肤病,慢性宫颈炎,呼吸道病 毒感染和妇科疾病,丘疹皮疹,造血系统恶性肿瘤,淋巴瘤,其主要标志。 β干扰素治疗多发性硬化症复发静脉使用。主要 γ-干扰素治疗类风湿关节炎。 γ干扰素的免疫功能比 α,β-干扰素强 1000 倍,不仅能增强机体免疫功能,自身 免疫性疾病, 还可以调整过渡到接近正常水平的免疫力。干扰素还用于生殖器衣 原体感染,膀胱癌,生殖器疣,皮肤疾病,血液病,艾滋病相关综合征的治疗。 世界上许多国家已批准生产和使用基因重组干扰素制剂为许多疾病的治疗。 治疗 后的临床应用表明,通常不严重的副作用,干扰素治疗,临床适应症正在不断发 展扩大了干扰素的新用途 。 3 干扰素的生产过程及优化生产 3.1 干扰素的生产过程及注意事项 3.1.1 菌种制备 取-70℃下保存的甘油管菌种(工作种子批) ,于室温下融 化。然后,接入摇瓶,培养温度 30℃,pH7.0,250 r/min 活化培养 18± 2 小时后, 进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。 3.1.2 种子罐培养 将已活化的菌种接入装有 30L 培养基的种子罐中, 接种量 10%,培养温度 30℃,pH7.0,级联调节通气量和搅拌转速,控制溶解氧为 30%, 培养 3~4 小时,转入发酵罐中,同时取样发酵液进行显微镜检查和 LB 培养基 划线检查,控制杂菌。 3.1.3 发酵罐培养 将种子液通入 300L 培养基的发酵罐中,接种量 10%,培 养温度 30℃,pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速,控制溶解氧 30%,培养 4 小

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时。然后控制培养温度 20℃,pH6.0,溶解氧 60%,继续培养 5~6.5 小时。同时 进行发酵液杂菌检查,当 OD 值达 9.0± 1.0 后,用 5℃冷却水快速降温至 15℃以 下,以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中,加入冰块使温度迅速降至 10℃以下。 3.1.4 菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机,16000 r/min 离心收 集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳 定性等项目的检测。菌体于-20℃冰柜中保存时,不得超过 12 个月。每保存 3 个月,检查一次活性。 3.1.5 干扰素发酵过程控制 在假单孢杆菌的发酵生产中,菌体在培养 1.5 小时分裂速度最快,到 3.5 小 时开始下降。而干扰素的迅速合成出现在 3.5 小时之后,在 4 小时达到最大,然 后由于降解而迅速下降。 可见在发酵生产工艺中,假单孢杆菌的生长和干扰素的 生产基本处于不相关状态,可采用两段培养的策略进行过程控制。 (1).溶解氧控制 分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度,以 期提高干扰素的发酵水平。通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。 (2).温度控制 假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。 产物 合成温度控制在 20℃可以有效防止干扰素-α2b 的降解,而其最佳生长温度则为 30℃。 质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降,因此在培养后期降温可以减少目 标产物的降解,增加质粒的稳定性。 (3)pH 值 发酵过程中,pH 的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条 件所决定。干扰素-α 的等电点在 pH 6.0 附近,在低酸性条件下稳定,能耐受 pH 2.5 的酸性环境。因此可在发酵后期降低 pH,从而造成大量蛋白酶失活,减少干 扰素-α 的水解,提高干扰素的积累量。 3.2 干扰素的优化生产 对于基因工程干扰素在产业化生产中的几大影响因素,我们应该掌握其原 理,尽可能改善工艺,达到优化的产业化生产干扰素。 3.2.1 高效的载体宿主系统 用作重组的表达载体需要具备以下性质:很强的启动子,能为宿主的 RNA 聚合酶所识别;很强的终止子,以便使 RNA 聚合酶集中力量转录克隆的基因,

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而不去转录其他的基因;启动子必须受控制,只有当诱导时才能被转录;所产生 的 mRNA 必须具有翻译的起始信号,即 AUG 和 S-D 序列.表达载体的启动子种 类很多, 使用最多的启动子是 λ 噬菌体的 pL 和 pR 启动子, 它们不但启动子强度 高,而且受基因产物的严格控制。尤其是利用 CI 温度敏感突变株十分方便,当 温度在 30℃生长时,CI 阻遏蛋白牢牢地阻遏启动子,把温度提高到 40-42℃时, 则立即消除阻遏,从 pL 或 pR 进行大量的转录并翻译。在干扰素生产过程中, 在 30℃发酵 8h,在 42℃发酵 2h 诱导表达即可.表达产物形成包涵体,优点在于 表达稳定、量多,缺点是恢复蛋白质的天然结构才能充分地显示生物活力。 常在基因工程干扰素的生产中用大肠杆菌做宿主细胞。 将干扰素序列精确定 位于大肠杆菌的乳糖启动子附近提高表达效率 1000 倍以上。 3.2.2 工程菌发酵培养基 为实现外源基因的高效表达,工程菌的培养技术也是非常重要的,工程菌发 酵培养基的组成和配比不仅要满足工程菌生长代谢需要, 还要利于目的的产物的 表达, 即使同一组分对于工程菌的生产和目的产物表达的影响也有所差异,因而 在优化过程中,要抓住主要因素,根据实际需要进行取舍。 3.2.3 干扰素发酵工艺 传统的细菌培养方式通过手控调整搅拌速度和通气量, 会导致细菌生长环境 的突然改变, 影响工程菌的生长繁殖而我国自行设计的适应工程菌发酵的程序控 制法,在培养基菌种、pH、温度等条件不变的情况下,可自动调节工程菌生长 繁殖的最佳条件,其环境变化温和、平稳,有利于工程菌的生长繁殖另外,以往 的批式培养在工程菌生长繁殖的对数期营养物质已基本耗尽,细菌生长速度减 慢,对数期随之缩短,很快进人稳定期-衰亡期,而流加式培养补充了营养物质, 延长了对数期因此,提高了菌体的产量和干扰素表达量。 3.2.4 干扰素纯化工艺 干扰素是一种纯净的在具体路线干扰素纯化发展领域的重要课题, 我们必须 先了解干扰素纯化之间的物理和化学,生物差异,然后净化工艺设计和离子交换 层析和和杂质作为一个大容量,效率和高分辨率往往作为首选方法用分离介质, 疏水层析是两者之间的差额离子交换层析需要低离子强度和疏水相互作用色谱 法样品的种类和高离子强度固定化金属离子亲和层析在高解析度和低表达干扰

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素单克隆抗体亲和使用, 和干扰素杂质接近物理和化学性质的情况下,一般是凝 凝胶过滤层析, 能力在净化过程中的中间步骤小,回收率高纯化过程作为最后一 步,为转换系统或地方解决远离在混合蛋白靶蛋白。 α-干扰素的纯化,如工作, 以提高重组人干扰素 α2b,提高产品质量,降低成本,通过发酵培养,断裂应变, 包涵体提取,离子交换层析,制备纯干扰素凝胶过滤净化产品。结果表明,超过 95%纯度的具体活动干扰素 1.2 × 108 个国际单位/毫克以上。使用这种方法,产 量高,纯度,工艺稳定,适合大规模生产。

下面以大肠杆菌表达生产重组人干扰素-γ 为例对优化生产过程作介绍: 以常数和可变比生长速率进行分批补料发酵工艺,用于对表达人干扰素 -γ(hIFN-γ)的大肠杆菌 BL21(DE3)进行高细胞密度培养。通过控制气流和搅拌速 度,并在必要时充以纯氧,使溶氧水平保持在空气饱和度的 20%~30%。葡萄糖 是唯一的碳源和能源。 分别以常数和可变比生长速率补料策略进行分批发酵,在 36 和 20h 之后获得的终细胞密度分别达到了~100g 干细胞重/L。 后者得到的重组 hIFN-g 的最终比收率和总产量分别为 0.35 g/g 干细胞重和 0.9 g/(L· h)-1。采用新 的阴离子和阳离子交换色谱纯化程序,从包涵体出发纯化 hIFN-γ。rHu-IFN-γ 的 总回收率在~30%(100mg/g 干细胞重)。用 HPLC 检测 rHu-IFN-γ 的纯度,并进行 无菌度、 致热性和 DNA 含量测试, 以确保终产品中无有毒性物质和 E. coli 的其 它组分。 通过病毒细胞病变效应分析, 最终纯化的 rHu-IFN-γ 的抗病毒比活为 2 × 107IU/mg 蛋白。

参考文献
[1] 熊绍银. 干扰素简介[J]. 军事医学科学院院刊, 1985,(03) [2] 淋巴因子和干扰素[J]. 生物技术通报, 1990,(08) [3] 李万君. 人干扰素的种类及临床应用的安全性 [J]. 白求恩医科大学学报 , 1983,(05) . [4] 刘和堃. 干扰素的生产及其临床应用[J]. 微生物学免疫学进 展, 1980,(02) [5] 张磊, 刘睿. 干扰素给药研究[J]. 中国处方药, 2003,(06) [6] 窦 红 , 郑 煜 . 干 扰 素 的 应 用 及 不 良 反 应 [J]. 临 床 医 药 实 践 杂 志 , 2003,(09)

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