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鱼蛋白水解液脱苦研究进展


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鱼蛋白水解液脱苦研究进展
胡永平,娄永江*,时述航
宁波大学生命科学与生物工程学院,浙江宁波(315211)
E-mail:louyongjiang@nbu.edu.cn

摘 要: 本文简要介绍了鱼蛋白水解液苦味产生的原因, 详细阐述了影响鱼蛋白水解液苦味 的因素以及目前常用的各种脱苦方法,并对鱼蛋白水解液脱苦技术的发展方向进行了展望。 关键词:水解蛋白,脱苦,酵母,活性炭,β-CD

0 前言
目前,蛋白质缺乏仍然是全世界面临的一个严峻问题,根据联合国粮食及农业组织的数 据,每年全世界食用蛋白质短缺约 1800-2500 万吨。由于资源丰富,所含蛋白质品质优良, 人们将目光投到各种鱼类身上,采用多种方法进行加工利用。在常规加工方法中,鱼类尤其 低值鱼类的出肉率比较低,往往只有 35%左右,大量的鱼蛋白被浪费。为了提高鱼蛋白的 利用率,从上个世纪 80 年代开始,国内外科研工作者纷纷开展了对鱼蛋白的水解利用研究
[1]

。 鱼蛋白水解后功能和营养价值大幅提高,其水解产物游离氨基酸含量高,比例合理,必

需氨基酸含量均能超过 FDA/WHO 标准模式[2]。 这些水解产物可以用作食品加工中的营养强 化剂,可以用作病人的理疗食品,还可以被加工成各种调味料,应用空间十分广阔[3]。但是 鱼蛋白在水解过程会不可避免的产生不同程度的苦味, 限制了其产物的应用, 因此必须对鱼 蛋白水解产物进行脱苦处理。 本文着重对鱼蛋白水解过程中苦味产生的原因、 水解液苦味的 影响因素以及国内外相关脱苦方法进行介绍。

1 苦味产生的原因
鱼蛋白的水解有化学法和酶法两种,化学法由于反映条件剧烈,反应过程中氨基酸受损 严重,且对生产设备损伤比较大,多不采用。目前研究应用的比较多的是酶解法[4]。鱼蛋白 在酶解过程中,其结构会发生一系列明显的变化,具体表现为肽链被切断,生成分子量不等 的多肽, 同时一些原来包含在蛋白质内部的疏水性氨基酸被暴露出来, 当这些疏水性氨基酸 与舌上的苦味受体(味蕾)接触时便会呈现苦味。这些呈现苦味的肽被称为苦肽,研究表明 苦肽的苦味程度与苦肽的蔬水度、苦肽的氨基酸的位置以及苦肽的空间结构有关。

1.1 苦味与蔬水度之间的关系
因肽的苦味与裸露的疏水性氨基酸有关,可以推断蛋白质疏水性氨基酸含量越高水解产 生苦肽的可能性越大。 苦肽的疏水度除与疏水性氨基酸含量有关外还与含有的氨基酸的种类 有关,不同的氨基酸疏水度不同。一般来说疏水度比较大的氨基酸残基有 Lys、Val、Leu、 Pro、Phe、Tyr、Trp 等,这些氨基酸残基在多肽中的比例越高,则多肽的苦味就可能越强[5]。 此外,有研究表明,多肽的苦味还与肽链的长度有关,对于具有相同疏水度的多肽,肽链越 长,苦味越强。

1.2 苦味与氨基酸位置之间的关系
苦肽的苦味与氨基酸种类及其位置也有很大关系。 Ishbashi 等[6]人的研究表明当 Leu、 Phe、

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Thr 等疏水性氨基酸残基位于多肽 C-末端时,苦肽的苦味更强。同时他们指出,对于含有大 量中性氨基酸残基的多肽,只有当其侧链结构至少由三个碳组成时,多肽才会呈现苦味。而 Otagiri 等[7]人的研究表明,除疏水性氨基酸残基位于 C-末端苦味更强外,他们还发现碱性 氨基酸残基对苦味也有一定的贡献。当碱性氨基酸位于多肽的 N-末端时,多肽的苦味更强, 特别是 Arg 残基紧接着 Pro 残基时,肽的苦味特别强。但是如果在 Arg-Pro 之间加入对苦味 没有贡献的 Gly 时,苦味会大幅度的减弱。

1.3 苦味与多肽空间结构之间的关系
根据前人研究,许多研究者认为:苦肽的苦味与肽的空间结构有重要关系,苦肽呈现最 强的苦味时其分子构象是特定的。IshiVbashi[8]等关于 Pro 残基对多肽苦味贡献的研究表明, Pro 残基对苦肽产生苦味的最大作用是促使多肽分子构象发生变化,形成回转结构。另外他 们[9]认为,苦肽呈现苦味需要两个决定位点,且这两个位点在空间上要处于相邻位置上,其 空间距离约为 4.1A 左右。

2 影响鱼蛋白水解液苦味的因素
相对于化学法水解,酶解法制取水解蛋白具有着一系列优势,目前对于鱼蛋白水解利用 的研究也多集中于酶解法[4]。按照来源不同,目前应用于研究的酶主要分为微生物蛋白酶、 植物蛋白酶以及动物蛋白酶三大类。 各种不同的酶能够作用蛋白不同的位点, 得到不同的产 物, 其苦味程度也有所差异。 同时在各种水解条件下, 同种酶对鱼蛋白的水解程度也会不同, 这也影响产物的苦味程度。研究人员主要通过改变这些因素来控制水解鱼蛋白的苦味。

2.1 水解酶种类的影响
目前在食品工业上常用酶制剂为枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶、 风味酶以及一些其他各科研单位自己制备的酶类。 这些不同的酶类对其所水解的肽键具有不 同的专一性,水解得到肽的长度及结构组成便会有所不同,从而影响到水解产物的苦味。比 如胃蛋白酶主要水解亮氨酸与缬氨酸、 酪氨酸与亮氨酸以及芳香族氨基酸之间的肽键, 而胰 蛋白酶能专门水解与赖氨酸或精氨酸结合的肽键,可使大部分疏水性氨基酸位于肽链末端, 故可使蛋白水解液苦味值较低[10]。 科研人员主要通过选择对不同酶水解产物进行比较来筛选适宜的酶, 同时将各种酶组合应 用来降低水解产物的苦味。如刘志强等[11]对 Alcalase、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、风味酶分 步水解黄鳝蛋白的研究表明,四种酶中 Alcalase 的水解速度最快,水解程度最大,但其苦味 比中性蛋白酶、木瓜蛋白酶大的多;风味酶对于完整的大分子蛋白的水解能力最差,水解度 不高,但其具有良好的风味,苦味最低。他们分析这主要是因为 Alcalase 是一种内切酶,复 合风味酶是一种内切和外切混合酶, 所以前者水解能力强但苦味更高, 后者水解能力弱但风 味好。段振华[12]等对木瓜蛋白酶、1398 中性蛋白酶、Protamex 蛋白酶、风味蛋白酶、中性 蛋白酶+木瓜蛋白酶(酶量比 1:9)和 NFC 复合蛋白酶水解鳙鱼下脚料进行了研究,结果 表明 NFC 复合酶的水解产物,水解度最高,苦味分值最低。他们认为其降低苦味机理是该 酶有选择的作用在含亮氨酸较多的切点上, 产生了较多游离亮氨酸, 从而减少了含有亮氨酸 残疾的短肽的数目。 朱碧英等[10]用胃蛋白酶和胰蛋白酶的复合酶以及枯草杆菌 AS1398 蛋白 酶对鳀鱼粗蛋白进行了水解,他们发现胃蛋白酶复合水解的产物苦味要比枯草杆菌 AS1398 蛋白酶水解低, 他们认为原因主要在于枯草杆菌酶是一种非专一性蛋白水解酶, 水解产物中
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疏水性氨基酸不一定位于肽链末端, 导致获得的水解液中苦味肽含量高, 最终苦味比胃蛋白 和胰蛋白酶符合酶所水解的产物要高。余杰等[13]在利用龙头鱼制备海鲜调味料的研究中, 利用木瓜蛋白酶,As1.398 中性蛋白酶以及两种酶的混合酶来水解龙头鱼,制取水解液。他 们的研究结果表明木瓜蛋白酶水解龙头鱼的能力高于中性蛋白酶, 其水解也风味也好, 苦味 值低;复合酶水解能力更强,比任何单酶都要高,水解液的苦味也更低。

2.2 水解条件的影响
每一种酶均有其最佳水解条件,在不同条件下酶对蛋白质的水解程度不同,这就会导致 水解产物的苦味程度有所差异。 不少研究者在酶解鱼蛋白的研究过程中通过控制加酶量、 酶 解的温度、酶解 pH 值、酶解料水比以及酶解时间来控制水解产物的苦味。王长云等[14]在低 酶水解法提取无苦味鳀鱼水解蛋白的研究中发现利用 AS1.398 酶水解时加酶量是影响水解 液苦味和水溶性蛋白得率的主要因素, 温度影响其次, 时间影响最小, 他们在加酶量 50IU/ml, 时间 1.5h 的条件下获得了水溶性蛋白得率高且无苦味的鳀鱼水解液。 毋瑾超等[15] 温度 40oc, 利用复合酶降解低值鱼(鳀鱼占 70%,小杂鱼虾占 30%)蛋白,他们发现在复合酶水解过 程中,水解液苦味随酶量增加,作用时间延长而增加,水解温度从 40oc 上升到 50oc 时苦味 增加而从 50oc 升到 55oc 时苦味下降,总的趋势是水解率提高,苦味增加,水解率下降,苦 味也相应减轻。复合生物酶水解低值鱼的最佳条件为:酶量 0.15%,温度 50oc,水解时间 4h。周涛等[16]利用木瓜蛋白酶对鲐鱼加工废弃物进行水解,他们的研究结果表明在加酶量 为 2.0%和 2.5%时,反应时间达到 5h 以上时,鲐鱼水解蛋白水解度达到 32%以上,能感觉 出水解液呈明显苦味;当加酶量 1.0%和 1.5%,反应时间 6h 以内时产生苦肽极少,人的味 觉感觉不出,因而他们建议采用酶量为 1.25%,水解时间为 6h。

3 苦味的脱除
蛋白水解液苦味的脱除现在应用比较多的主要是理化脱苦和生物脱苦两大类方法。理化 脱苦的原理是利用添加物质对苦肽的吸附、包埋、掩盖等作用降低水解液的苦味;生物脱苦 主要是利用添加微生物或酶对苦肽的进一步降解作用达到脱苦目的[17]。

3.1 理化脱苦法
3.1.1 吸附法 活性炭是一种用途广泛的吸附材料,其对与非极性化合物和饱和键化合物以及分子量较 大的化合物具有较强的吸附能力[18]。不少研究者尝试利用活性炭处理水解液来脱苦。刘洋 等[19]在鳀鱼水解液脱苦实验中比较了不同粒度的活性炭对鳀鱼水解液脱苦的效果,结果表 明活性炭粒度的大小对脱苦效果有显著影响,颗粒越小,脱苦效果越好。同时他们将活性炭 的吸附效果与其他吸附剂如滑石粉、 漂白土的吸附效果做了比较, 结果表明活性炭对于鳀鱼 水解液的脱苦效果最好。裘迪红等[20]用占鲐鱼水解液体积 1.0%的活性炭处理水解液,均匀 搅拌后,在温度 40oc 下静置 40min 即达到较好的脱苦效果。刘承初等[21]研究表明用低剂量 的活性炭(0.25%-1.0%)处理鲣鱼水解液即可达到很好的脱苦效果。施文正等人在白鲢鱼水 解液脱苦研究中发现用 1.5%的活性炭,在 pH 为 4.5 条件下作用 0.5h 对水解液的脱苦效果 达到最佳,此时水解液蛋白回收率为 90.30%。虽然活性炭具有较好的脱苦效果,但同时也 带来了蛋白质的大量损失,因此常与其他方法结合使用。

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3.1.2 包埋法 在水解液包埋脱苦方法中,常使用的物质为环状糊精(β-CD) 。β-CD 一种环状低聚葡萄 糖,它有一个立体疏水空腔,能够以范德华力、疏水作用力与许多大分子形成包含物,因而 能够达到脱苦的目的。 由于其处理方法简单, 无毒性, 很容易受酸水解, 易被人体消化吸收, 刘洋等[19]研究了 β-CD 对鳀鱼水解液苦味的 所以被许多研究人员用来处理鱼蛋白水解液[22]。 掩盖作用,结果表明 β-CD 对鳀鱼水解液的苦味有明显的掩盖作用,当用量达到 10%时,其 苦味降低 81%。邓尚贵等[23]在青磷鱼水解液中加入 1.0%的 β-CD 并煮沸 3min,有效的掩盖 了水解液的腥苦味。 施文正等[24]在白鲢鱼水解液脱苦研究中发现 β-CD 对于白鲢鱼水解液苦 味的掩盖作用不佳,他们认为原因可能是白鲢鱼水解液苦味肽分子相对与 β-CD 空腔太大, β-CD 无法有效掩埋所致。除 β-CD 外,其他常用的掩盖剂还有聚磷酸盐、明胶、改性淀粉、 牛磺酸等[25]。 3.1.3 萃取法 研究表明用共沸异丁醇提取酶蛋白水解产物中的苦肽可以取得很好的效果,但是这种方 法必需氨基酸以及其他氨基酸损失较大,会影响其营养价值。裘迪红等[20]在鲐鱼水解液脱 苦实验中用占水解液质量 50%的乙醚加入水解液中,振摇 20min 后静止分层,分液后得到 萃取液,在加热除去萃取液中的乙醚,重复 3 次,鲐鱼水解液的脱苦脱腥效果较好。李春美 等[26]用乙醚萃取鱼鳞水解液体的腥苦味,结果表明脱除效果随萃取次数的增加而提高,但 同时氨态氮的损失也增加,综合考虑他们认为萃取两次效果最好。除此之外,乙醇、异丙基 乙醇都可以作为萃取剂除去水解液中的苦味。

3.2 生物脱苦法
目前,在鱼蛋白水解液脱苦中应用的方法主要为酵母法以及各种外切酶法。 3.2.1 酵母法 酵母脱苦脱腥的原理目前还不是很清楚,根据推测可能是由于以下几方面作用[27]:①酵 母疏松的结构对于腥苦物质的吸附作用; ②酵母生命活动对于各种腥苦物质的利用转化; ③ 酵母生命活动产生的各种酶对于腥苦物质的转化。 不少研究者对酵母脱出鱼蛋白水解液的苦 味作了大量的研究。裘迪红等[25]在鲐鱼水解液脱苦实验中对酵母脱苦进行了研究,他们的 研究结果表明随接种量的增加,去腥苦效果增加,但大于 2%时会产生异味。在处理时间为 1h 内,去腥苦效果随温度升高和培养时间延长而增加,但超过 1h 时会产生较重异味。同时 他们比较了活性炭、β-CD 以及酵母三种方法的脱苦效果,结果表明酵母的对于鲐鱼水解液 的脱苦效果最好。邓尚贵[22]在青鳞鱼水解液脱苦研究中发现,在水解液中加入 0.5%的酵母 粉在 40oc 下处理 30min 就能除去 β-CD 不能完全掩盖的腥苦味。施文正[23]等人利用酵母粉 进行白鲢鱼水解液脱苦实验, 正交实验结果表明各因素对脱苦效果影响程度分别为酵母粉添 酵母粉添加量为 1%, 作用时间为 1.5h。 加量>作用温度>作用时间, 最佳脱苦条件为温度 35oc, 3.2.2 酶法 酶法脱苦主要是利用外切酶将苦肽的疏水氨基酸切除使其释放,从而降低苦味。根据切 除原理不同外切酶可分为氨肽酶和羧肽酶, 氨肽酶主要切除位于多肽和蛋白质肽链氮端的疏 水性氨基酸, 而羧肽酶主要切除肽链碳端的疏水性氨基酸。 目前应用于鱼蛋白水解液脱苦的

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外切酶类主要是风味酶。 刘志强等[11]在制取黄鳝低肽的研究中发现在 Alcalase 水解黄鳝蛋白 时,在初期水解液苦味较小,随水解过程的进行,水解度增大,水解液苦味值逐渐增大,水 解 90min 后,加入风味酶二步水解,45min 后苦味基本消失。李铁晶等[27]在鳕鱼水解液风味 改良研究中发现,风味蛋白酶可以有效的改善水解液的风味,最佳条件为:水解温度 55oc, 酶添加量为 3%,ph 为 5.5。游海等[28]将风味酶应用于鳝鱼废弃物蛋白水解液脱苦,结果表 明水解液苦味值降低很多, 而且还提高了水解液的水解率。 为此他们提出可用中性蛋白酶对 鳝鱼废弃物蛋白先水解再用风味酶二次水解,可以获得水解率高,风味好的产物。章叶江等
[29]

在酶法水解鲣鱼头研究中利用风味酶与木瓜蛋白酶联合使用,结果发现可以获得腥味和

苦味均比较低的水解液。汪涛等[30]在扇贝边蛋白水解研究中发现,先用混合内肽酶水解后, 再用风味酶进行二次水解,可以有效的降低水解产物的苦味,同时也能够彻底水解蛋白质, 增进和改善水解液的风味。除外切酶法外,还有人用塑蛋白反映来降低水解液的苦味,其主 要原理是高浓度的蛋白质水解物与蛋白酶在一定条件下形成凝胶状的蛋白质物质, 掩盖了疏 水性氨基酸的残基,达到脱苦目的。这种方法的缺点是得到到蛋白水解物不可溶,因而限制 了其应用。

4 小结
应当指出的是以上的每种方法尤其是各种理化方法均有不同的缺陷。 有的方法脱苦效果 好,但蛋白损失高;有的方法蛋白蛋白损失低,但脱苦效果不好。因此此有不少研究人员将 其组合使用,比如将活性炭脱苦与 β-CD 联合脱苦联合使用,均取得了不错的效果。 生物脱苦法因其不引入化学添加剂, 且脱腥苦效果比较好, 被越来越多的科研人员所采 用, 这将会是鱼蛋白水解液脱腥苦研究的发展方向。 根据目前的研究现状我们认为生物脱苦 今后的研究重点应该集中在两方面:一是寻找更多、更高效的生物脱苦剂,二是对各种生物 脱苦剂的脱苦机理展开研究。 相信随着各种脱苦技术研究的不断深入,鱼蛋白水解液的苦味问题一定会得到更好的解 决,从而加速其产业化进程,更好的为人类所利用。

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The review of researches on debittering fish protein hydrolates
Hu Yongping,Lou Ynongjiang,Shi Shuhang
Faculty of Life Science and Biotechnology,Ningbo University,Ningbo,Zhejiang (315211) Abstract An introduction of bitterness formation in fish protein hydrolates was present, a review of factors infecting the bitterness and methods of debittering the hydrolysates was given in details, and the new trend of devdlopments in the field was suggested. Keywords:protein hydralysate,debittering,yeast,active carbon,β-CD 作者简介: 胡永平,1982 生,男,汉族,山东烟台人,硕士研究生.研究方向:食品加工与保鲜; 娄永江,1964 年生,男,汉族,浙江绍兴人,副教授.研究方向:水产品加工与储藏。

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