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胡学才 细胞重组技术及克隆


第14章 细胞重组及动物克隆技术
学 年 学 姓 院:生命科学学院 级:2013级12班 号: 201311421207

名: 胡 学 才

指导老师:伍 老 师

14. 动物细胞重组及物克隆技术
? 14.1 细胞重组技术

?
?

14.2
14.3

细胞核移植和动物克隆技术
动物克隆技术的意义与展望

细胞重组的概念:
? 细胞重组(cell reconstruction)是指从活细 胞中将细胞器及其组分分离出来,再在体外 一定条件下将不同来源的细胞器及其组分重 新组合,使之重新装配成为具有生物活性的 细胞或细胞器的一种实验技术。

14.1.1 细胞重组的方式
? (1)胞质体与完整细胞重组形成胞质杂种

? (2)微细胞与完整细胞重组成微细胞异核体

? (3)胞质体与核体重新组合形成重组细胞

14.1.2 细胞重组的原料
? (1)胞质体:除去细胞核后由膜包裹的无核 细胞; ? (2)核体: 与细胞质分离的细胞核; ? (3)微细胞:又称微核体,由一条或几条染 色体、 少量细胞质和完整质膜包裹而成; ? (4)胞质杂种细胞:将胞质体与另一完整细 胞融合得到的细胞。 ? (5)杂种细胞:核体与完整细胞融合。

利用细胞融合技术得到的重组细胞

微细胞的制作过程

14.2 细胞核移植和动物克隆技术
? A.细胞核移植技术:所谓核移植技术就是利 用显微操作技术将一个细胞的细胞核移植到 另一个细胞中,或者将两个细胞的细胞核 (或细胞质)进行交换,从而可能创造无性 杂交生物新品种的一项技术。

? B.动物克隆技术:是指一个细胞或个体以无 性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细 胞或一群个体。 ? 在动物繁殖学中,它是指不通过精子和卵子 的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体 的一门胚胎生物技术。

近年来我国核移植技术的发展

克隆的层次
? A.分子水平上的-----基因克隆 ? 重组载体通过宿主细胞的无性繁殖使目的基因扩增, 再用某探针选取、钓取目的基因。 ? B.细胞水平上的------细胞系的培养(制备单克隆抗体) ? 单克隆抗体:利用动物细胞融合技术将骨髓瘤细胞和 能产生抗体的B淋巴细胞融合得到杂交瘤细胞,再去 培养,筛选到杂交瘤细胞系。 ? C.在个体水平上------繁殖出生物个体 ? 不通过两性细胞的结合,从一个单一的细胞繁殖出生 物个体。即细胞 ------- 个体
? -

基因水平的克隆

细胞水平上的克隆-----单克隆抗体制备

植物组织培养过程
(无菌)切下根尖 无菌培养 形成愈伤组织 组织分化形成器官

发育成新个体
无菌培养

植物细胞的全能性

14.2.1核移植技术的一般操作程序
?

? Ⅱ.和供体细胞的准备:在核移植操作中, 细胞核供体细胞首先必须是完整的二倍体, 该细胞必须保持有供体动物完整的基因组; ? 其次,供体细胞核必须能够在受体细胞 质的作用下,产生细胞分化过程的倒转, 变得如同刚刚受精的合子一样,能重新完 成从受精到发育成一个正常动物个体的全 过程。 ? 供体细胞主要有两大类:胚胎卵裂球和体 细胞。另外,核供体细胞的来源还有胚胎 干细胞和胎儿成纤维细胞。

? Ⅲ.细胞核移植:常用的核移植方法有两 种,即胞质内注射和透明带下注射。胞质 内注射是用一个外径5~8μm 的注核针吸 取供体核后直接注射进卵母细胞胞质内的 方法。透明带下注射则是把供体细胞核注 射在透明带与卵母细胞之间的卵周隙中, 核移植后用电刺激进行细胞融合。

直接注射法制作重组胚过程

? Ⅳ.激活:卵母细胞的激活涉及的因素 很多,无论是受精引起的卵母细胞激活 还是人工的激活,都会引起卵母细胞发 生一系列的反应,这些反应是胚胎发育 所必需的。其激活原理是通过电刺激、 钙离子载体等方法,使卵母细胞从MII 期中解放出来,并转到“受精”的状态

? Ⅴ.重组胚的培养:经融合和激活的重组 胚移入中间受体作体内或体外培养,观察 重组胚的发育率。羊、牛、猪的核移植胚 常采用体内培养方法获得桑椹胚和囊胚, 即羊和牛的重组胚用琼脂包埋后移入休情 期的母羊结扎的输卵管中体内培养4-7d, 发育至桑椹胚和囊胚。猪的核移植重组胚 移入同期化受体母猪输卵管内作体内培养 7d,发育为囊胚。大鼠、小鼠和兔的核移 植胚多作体外培养,发育至桑椹胚或囊胚。

? Ⅵ.重组胚的移植:重组克隆胚胎移植的受 体母畜要选择皮毛颜色与供体品种不同、 繁殖性能强、体格稍大的当地品种,进行 同期发情处理,按常规方法移植代孕母畜 (寄母)的子宫中,待其发育到产仔。
? Ⅶ.核移植后代的鉴定:一般可以从形态、 性别上鉴定,还可以采用分子生物学技术 进行鉴定。

14.2.2胚胎细胞核移植
? 1981年,Illmensee报道了通过核移植的方法克隆小鼠, 这是哺乳动物克隆的首例成功。他们将囊胚内细胞团细 胞的核移入受精卵中,同时在吸管撤出时将两个原核吸 出,以减少受精卵内部被破坏的机会,经培养,移核卵 发育至囊胚期,再将此胚胎植入同步孕鼠的子宫内,最 后产下两雌一雄三只可育的个体。 ? 1983年,McGrath和Solter对核移植技术加以改进,他们 将显微镜技术与细胞融合技术相结合。 ? 1986年,Willadsen将绵阳8-细胞期胚胎的卵裂球移入未 受精的成熟卵子中,成功克隆了一只小绵羊。 ? 1987年,利用显微镜技术和电融合技术首次培育出了克 隆牛。 ? 1988年,在克隆兔的研究中首次应用了电击活技术。

胚胎细胞核移植培育克隆鼠的过程

14.2.3 体细胞克隆
? 在20世纪50年代利用体细胞克隆成蛙, 其后科学家一直在努力期望利用体细胞 克隆出哺乳动物。

在1997年,Wilmut等利用成体绵阳的乳 腺细胞进行核移植,克隆出了------Dolly.

Dolly的产生过程

动物克隆的大记事

? 1938年,德国科学家HansSpemann建议用成年的细胞 核植卵子的方法进行哺乳动物克隆。 ? 1952年,英国的Briggs和King开始克隆青蛙,虽未能成 功,但开始寻找克隆技术。 ? 1962年,英国剑桥大学的Gurdon宣布他用1个成年蛙细 胞克隆出1只蝌蚪,从而引发了关于克隆的第一轮辩论。 ? 1965年,中国实验胚胎学家童第周完成了金鱼核移植 并获得成功。 ? 1983年,美国科学家Mcgrath和Solter克隆出小鼠。 ? 1984年,丹麦科学家Willadsen用胚胎细胞克隆出1只羊, 这是第一例得到证实的通过核移植技术克隆出的哺乳 动物。

? 1996年,英国人IanWilmut成功获得体细胞克隆羊“多 利”,这是世界上第一例利用成年体细胞核获得的克 隆动物。 ? 1997年,中国学者孟励在美国用胚胎细胞克隆猴获得 成功。 ? 1998年,一个多国联合科学小组用1个人的腿部体细胞 与1个奶牛的卵细胞结合,成功克隆了1个人的胚胎, 但只“生活”发育了12d就被有意毁掉。 ? 1998年~1999年,美国人White用珍稀动物盘羊的体细 胞核与牛卵结合;韩国的黄禹锡将白头山老虎体细胞 核与牛卵结合;我国学者陈大元将大熊猫体细胞核与 兔卵结合,均成功克隆出早期胚胎。 ? 2000年,美籍华裔学者杨向中领导的研究小组利用17 岁公牛耳部皮肤的成纤维细胞成功获得克隆牛。

? 2000年,美国科学家成功地克隆出首例灵长类动物—— 一只恒河短尾猴“泰特拉(Tetra)”。与其它动物克隆 不同的是,“泰特拉”未用细胞核移植技术,而是采用 胚胎分解的方法,将受精卵培育卵裂至8个细胞时将其 分离,每2个细胞分为一部分,共分为4部分,并分别植 入4个“代理母亲”子宫中,结果有一个“代理母亲” 成功生下了“泰特拉”,这意味着克隆人类已没有技术 障碍。 ? 2000年6月22日,我国生物胚胎专家张涌在西北农林科 技大学种羊场顺利接生了1只雌性体细胞克隆山羊“阳 阳”。“阳阳”经自然受孕后,并于2001年8月8日产下 一对混血儿女,雄性叫“欢欢”,雌性叫“庆庆”,都 是体细胞克隆山羊“阳阳”与世界首批胚胎克隆山羊交 配的后代。“阳阳”的生产可以证明体细胞克隆山羊和 胚胎克隆山羊具有与普通山羊一样的生育繁殖能力。 ? 2001年,美、意科学家联手展开克隆人的工作,但遭到 国际社会的普遍反对。

? 异种克隆:也叫异种核移植,是指将某一动物的细胞核 通过显微操作移植到另一种动物的去核卵母细胞中,并 使之发育的过程,可用于探索细胞核在异种动物卵母细 胞中分化的潜能。

14.2.4 异种克隆

? 2003年中国首例种间北山羊在新疆诞生

异种克隆动物诞生的意义
? 进一步说明已经分化的细胞核保留有发育为完整个 体所需的全部遗传信息,动物异种体细胞核移植技 术具有可行性,该技术为珍惜濒危动物保护繁殖展 示了新的希望。

14.3 动物克隆技术的意义及展望
? Ⅰ.促进生物学基础问题的研究 ? Ⅱ.加速良种繁育,保护濒危动物 ? Ⅲ.培育转基因克隆动物,生产生物 药品 ? Ⅳ.与基因和干细胞技术结合,开展 治疗性克隆

治疗性克隆
? 长期以来,围绕克隆的争论主要在两种 目的不同的克隆研究之间展开,也就是 生殖性克隆和治疗性克隆。生殖性克隆 是指克隆出一个完整的人,大多数国家 和地区都旗帜鲜明地予以反对。然而对 于治疗性克隆这种以治病救人为目的的 研究,虽然有着比较高的支持率,但也 存在着不同的声音。

? 治疗性克隆指把患者体细胞移植到去核卵母细胞中 形成重组胚,把重组胚体外培养到囊胚,然后从囊 胚内分离出ES细胞,获得的ES细胞使之定向分化为 所需的特定细胞类型(如神经细胞,肌肉细胞和血细 胞),用于替代疗法。 ? 这种方法的最终目的是用于干细胞治疗,而非得到 克隆个体。运用克隆技术获得人体早期胚胎,但目 的不是将胚胎培育成人,而是为了提取全能型的胚 胎干细胞,然后在合适的条件下,使其发育成为人 体的任何一个器官,包括大脑、肌肉、血液和神经, 这些器官组织将用于医疗。 ? 目前治疗性克隆已获得不少国家的默许。

? 如果在胚胎已经成为生命之后,是否可 以剥夺其生命再去救治一个已在人世的 生命? ? 如今多数观点同意治疗性克隆研究中 培养胚胎不得超过14天,认为这期间胚 胎尚未成为“人”,而如何对这一底线 进行严格控制和监管,依然是摆在人们 面前的一个问题。

克隆技术存在的问题
? 理论问题 ? 分化的体细胞克隆对遗传物质重编(细 胞核内所有或大部分基因关闭,细胞重 新恢复全能性的过程)的机理还不清楚; ? 克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。 ? 克隆动物的连续后代是否会累积突变基 因。 ? 在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作 用等问题还没有解决。

? 实践问题 ? 克隆动物的成功率还很低 ? 生出的部分个体表现出生理或免疫缺陷。 ? 即使是正常发育的“多莉”,也被发现 有早衰迹象

如何迎接“克隆时代”的挑战
? ⒈人类从有性生殖回到了无性生殖,无疑 ? 是一个巨大的倒退。 ? ⒉“克隆人”没有父母,没有亲情,社会将 ? 会变得冷酷无情。 ? ⒊“克隆人”成年后也有可能会通过有性繁 殖来繁衍后代,不知不觉地就可能造成大量 的近亲结婚,其后果是不堪设想的。 ? 人兽胚胎、基因测序、克隆人、换脸术、设 计婴儿……

你如何看待克隆人

思考题
? 1.什么是胞质体、核体、微细胞?概述他们的 制备方法。 ? 2.试述哺乳动物细胞核移植的一般操作程序。 ? 3.动物克隆技术的应用前景如何?还存在哪 些问题? ? 4.你对克隆人极其组织有何感想?


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